与大豆花叶病毒P3N-PIPO基因互作的大豆基因的鉴定及分析

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中文摘要：大豆花叶病毒（Soybeanmosaicvirus，SMV）病是一种全球性大豆病毒病害，广泛分布于我国各大豆主产区，严重影响大豆的产量与品质。寻找有效的抗病基因是应对大豆花叶病毒病，培育抗病品种的关键。研究病原-寄主的蛋白互作不仅有助于深入了解病原物的侵染机制，并且可以从中挖掘一些有效抗性基因，为培育具有持久抗性的大豆新品种奠定基础。 SMV属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），该属病毒的基因组是一条单链正义RNA，翻译加工后产生11个成熟蛋白。其中P3N-PIPO蛋白是Potyvirus属中新发现的蛋白，功能了解较少。近期的研究表明P3N-PIPO主要与病毒的细胞间运动有关。病毒蛋白功能的实现需要寄主蛋白的参与，本研究以SMV-P3N-PIPO为诱饵利用酵母双杂交技术筛选大豆中与其互作的蛋白，并通过与之互作的寄主蛋白进一步推测P3N-PIPO功能。在酵母双杂交方法筛选的互作蛋白中我们依据NCBI预测的蛋白功能选择4个感兴趣的蛋白:GmBSP、GmGOS1-2、GmVAMP722、GmHB6作为候选蛋白，并利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术对P3N-PIPO与候选蛋白的互作区域进行了进一步研究，利用qRT-PCR技术对候选基因在SMV侵染条件下的表达进行了初步分析。主要结果如下: 1.与大豆花叶病毒P3N-PIPO蛋白互作的大豆蛋白的鉴定利用SMV6067-1分离物的P3N-PIPO序列构建诱饵载体，通过酵母双杂交技术初步筛选大豆品种南农1138-2的cDNA文库，共筛选到54个与P3N-PIPO互作的大豆寄主蛋白。利用大豆基因组数据库Phytozome和NCBI数据库Blast分析表明这些蛋白涉及到寄主防御、转运、初级代谢、次级代谢、能量代谢、DNA连接、信号转导、转录和细胞膜运动。利用String软件对这些蛋白进行蛋白互作网络分析，结果显示，这些蛋白涉及到三个明显的植物生理途径:信号转导途径，细胞囊泡转运途径和叶绿体光合系统途径。在鉴定出的大豆寄主蛋白中，转运相关蛋白占较大比例(15％)，蛋白互作网络分析显示一些与SMV-P3N-PIPO互作的蛋白涉及到细胞囊泡转运途径，与之前报道的P3N-PIPO介导病毒胞间转运功能相符;寄主防御相关蛋白也占最大比例(17％)，蛋白互作网络分析显示一些与SMV-P3N-PIPO互作的蛋白参与了寄主信号转导和叶绿体光合系统途径，这些途径和SMV引起的大豆症状形成相关，表明P3N-PIPO除了介导病毒胞间转运外可能在病毒的致病性方面也存在一定作用。 2.与SMV-P3N-PIPO互作候选基因的克隆与生物信息学分析以大豆品种南农1138-2的cDNA为模板，PCR扩增4个候选蛋白的基因序列，利用氨基酸多重序列比对，系统发生树和跨膜结构域预测相关软件对候选蛋白进行生物信息学分析。结果表明GmBSP含有基本分泌蛋白（basicsecretoryproteins，BSP）保守结构域，属于谷氨酸锌蛋白家族，氨基酸序列比对发现与大豆品种Williams82中鉴定到的烟草花叶病毒抗性蛋白GmTMVRP的C端具有高度同源性，具有一个典型的跨膜结构域;GmGOS1-2不包含保守结构域，具有一个典型的跨膜结构域，与野生大豆中的GsGOS1-2亲缘关系最近;GmVAMP722保守性最强，含有Login和R-SNARE多个保守结构域，具有一个典型的跨膜结构域;GmHB6是植物中特有的转录因子，含有抗病基因常有的典型的亮氨酸拉链(HD-ZIP)结构域，不包含典型的跨膜结构域。 3.SMV-P3N-PIPO与候选蛋白的互作区域研究利用酵母双杂交和双分子荧光互补两种蛋白互作技术对SMV-P3N-PIPO与候选蛋白的互作进一步验证，并对其互作区域进行了研究。结果显示，GmBSP和GmHB6与SMV-P3N-PIPO全长互作，与单独的P3N或PIPO端均不互作;GmGOS1-2与SMV-P3N-PIPO全长或单独的PIPO端互作，与单独的P3N端不互作，表明其互作区域位于PIPO端。酵母双杂交研究显示GmVAMP722与SMV-P3N-PIPO全长或单独的PIPO端互作，与单独的P3N端不互作，表明其互作区域位于PIPO端。而双分子荧光互补研究表明GmVAMP722与SMV-P3N-PIPO全长互作，与单独的P3N端或单独的PIPO端均不互作。 4.候选基因在SMV侵染条件下的表达研究利用大豆品种南农1138-2和SMV6067-1分离物为材料采用汁液摩擦接种方法对候选基因在SMV侵染条件下的表达进行qRT-PCR研究，磷酸缓冲液处理作为对照。结果显示在SMV侵染后24h前的接种叶中，4个候选基因的表达量和对照相比差异没有明显规律，但相对于Oh均有上调表达，表明4个候选基因均对机械损伤有响应。在SMV侵染24h时，4个候选基因的表达量显著高于对照，且在接种叶的上位中GmBSP，GmVAMP722，GmHB6的表达量持续高于对照，表明GmBSP，GmVAMP722，GmHB6受SMV侵染的诱导上调表达，可以作为抗SMV相关基因进一步研究。

作者：

宋普文

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关键词：

大豆大豆花叶病毒候选基因蛋白互作酵母双杂交

授予学位：

博士

学科专业：

作物遗传育种

导师：

智海剑

学位年度：

2016

学位授予单位：

南京农业大学

语种：

中文

中图分类号：