摘要
研究背景 世界卫生组织报告指出，2015年全球有78.8万人死于肝癌，位居所有癌症病死率第二位。在我国，2015年新发肝癌病例数为46.6万例，占所有癌症发病率10.8％，因肝癌死亡人数为42.2万人，占所有癌症死亡率14.9％。目前医学界针对肝癌中最为常见的肝细胞性肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)的主要治疗手段为外科切除、肝移植、放疗、化疗等，但上述治疗手段有着愈后较差、对机体损伤较大以及耐药现象等，使对肝癌的有效治疗进入瓶颈阶段。 热休克蛋白90(Heatshockprotein90，Hsp90)是高度保守的一种分子伴侣，几乎在所有物种的细胞质都有大量表达，当机体处于应激状态时，其表达量将迅速上升。目前所发现Hsp90的200多种底物蛋白大多与细胞增殖、代谢等密切相关，表明Hsp90在肿瘤细胞的转归中发挥着关键的作用，另外，Hsp90在多种肿瘤细胞中均大量表达，且被证实与促进肿瘤细胞恶性进展有关，提示其有望成为癌症预防与治疗的关键靶点。 近年来，针对Hsp90的抑制剂研发成为学术界的研究热点，按照其作用的位点不同主要分为3类:N端抑制剂、M端抑制剂、C端抑制剂。其中进入临床试验阶段的主要为N端抑制剂。以STA9090为代表的Hsp90N端抑制剂与N端相应的底物蛋白竞争性争夺N端结合位点，使底物蛋白无法正常结合而被降解。而C端抑制剂新生霉素(Novobiocin，NB)则通过与Hsp90C端结合，使其无法二聚化及发挥正常功能，因此NB不会引起细胞明显的热休克反应。由于HCC的发生发展与多种细胞信号转导通路有关，而参与这些通路的多种的信号转导分子大部分是Hsp90的底物蛋白，更重要的是，Hsp90在肝癌细胞中大量表达，提示Hsp90在维持肝癌细胞增殖，抵抗细胞凋亡中可能起着十分重要的作用。因此，以Hsp90作为靶点进行抑制干预，有可能进一步达到抑制肝癌的效果。 电压依赖阴离子门控通道1(Voltagedependentanion-selectivechannel1，VDAC1)是位于线粒体外膜上的通道蛋白，其作用是构成线粒体通透性转换孔，控制物质进出线粒体，参与细胞的能量代谢、细胞损伤与修复、自噬、凋亡等细胞活动。在细胞应激状态下，由VDAC1寡聚化形成的大孔径膜通道可以使蛋白大分子进出线粒体，因此VDAC1的寡聚化被认为与线粒体介导的细胞凋亡有着十分密切的关系。细胞凋亡分为外凋亡与内凋亡，其中内凋亡又称线粒体介导的细胞凋亡。当线粒体接收到细胞内的凋亡启动信号后，位于线粒体外膜的VDAC1开始寡聚化，线粒体通透性转换孔打开，线粒体内的细胞色素C(CytochromeC，cyto-c)释放到胞浆中，随即启动Caspase级联反应，细胞走向凋亡。有学者指出，NIMA相关蛋白激酶1(NIMA-relatedproteinkinase1，Nek1)能使VDAC1磷酸化，磷酸化后VDAC1无法形成寡聚体，参与线粒体相关的细胞凋亡进程，是影响VDAC1功能的重要蛋白。将VDAC1视为针对肿瘤治疗的靶点，利用VDAC1诱发肿瘤细胞启动凋亡具有一定程度的临床意义。 综上所述，Hsp90与VDAC1均在肿瘤细胞中高度表达、均为高度保守的蛋白分子，是具有临床意义的肿瘤治疗潜在靶点。且有研究证明，两者之间存在一定的相互作用关系，因此，研究Hsp90与VDAC1之间的相互作用机制，以及两者对细胞凋亡通路的影响，有望为肿瘤药物研发提供理论依据。 目的: 1.使用不同浓度STA9090、NB处理人肝癌细胞株HepG2、Huh7，观察Hsp90对VDAC1蛋白表达量的影响。 2.探究Hsp90不同结构域对VDAC1寡聚体形成的影响。 3.研究Hsp90N抑制剂、C端抑制剂对诱发HepG2细胞凋亡的效果。 4.确定Hsp90与Nek1的相互作用关系。 5.探索STA9090与干扰Nek1联合处理是否能诱发HepG2细胞凋亡。 方法: 1.用CCK8检测不同浓度的STA9090、NB处理两种HCC细胞系HepG2、Huh7细胞的细胞活力，得出两个细胞系对两种Hsp90抑制剂的IC50。 2.用westernblot检测STA9090、NB处理后的HepG2和Huh7细胞VDAC1蛋白水平变化。 3.利用原子粗颗粒化模型对Hsp90、VDAC1进行建模，并模拟两者在自然状态下的相互作用模式。 4.用浓度分别为0.5mM、0.5μM的STA9090、NB处理HepG2和Huh7细胞，再运用化学交联剂EGS处理，用westernblot检测各组间VDAC1寡聚体形成的差异。 5.分离线粒体、胞浆蛋白，westernblot检测线粒体蛋白cyto-c、COXIV、β-Actin的表达量 6.用两种Hsp90抑制剂与凋亡诱导剂STS处理HepG2细胞，采用免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观测cyto-c与线粒体内参COXIV共定位情况变化。 7.用westernblot检测STA9090、NB处理后PARP的切割产物cleaved-PARP的蛋白水平变化。 8.用0.2μM、0.5mM、0.5μM的STS、STA9090、NB处理HepG2细胞，24h使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。 9.用westernblot检测STA9090、NB处理后Nek1的蛋白水平变化。 10.应用免疫荧光染色及激光共聚焦显微镜观测用STA9090、NB以及凋亡诱导剂STS处理后HepG2细胞内Nek1的荧光强度大小。 11.将Nek1的siRNA干扰片段转染到HepG2细胞中，用westernblot检测干扰以及干扰联合STA9090处理下，PARP的切割产物cleaved-PARP的蛋白水平变化。 结果: 1.抑制Hsp90的N端和C端均能使VDAC1表达下降。 2.Hsp90C端与VDAC1寡聚体形成有关，而抑制Hsp90N端则无法引起VDAC1寡聚化。 3.Hsp90C端抑制剂能诱发HepG2细胞凋亡，具体效应有细胞色素C释放、PARP被切割等，但N端抑制剂无法引起上述效应。 4.Nek1蛋白在Hsp90C端抑制剂处理后表达迅速下降，而N端抑制剂处理后Nek1无明显变化趋势。 5.干扰Nek1可诱导HepG2细胞凋亡，而干扰Nek1联合Hsp90N端抑制剂处理细胞后凋亡效应更明显。 结论: 1.抑制Hsp90影响VDAC1蛋白稳定性。 2.Hsp90C端抑制剂NB可诱导VDAC1寡聚化以及HepG2细胞凋亡，但N端抑制剂STA9090不能引起明显的细胞凋亡效应。 3.干扰Nek1联合抑制Hsp90N端可促进细胞凋亡。
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