摘要
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，居世界恶性肿瘤的第四位，发病率和死亡率居我国恶性肿瘤的第二位。由于其发病隐匿、分子机制不清、进展快、预后差，诊断明确时往往已处于中晚期。WTX(WilmsTumourgeneonXchromosome)，又名FAM123B，Amer1，是在Wilms瘤中发现的首个定位于X染色体上的抑癌基因。之前的研究表明，WTX还与硬化性骨病的发生相关，但其在其他肿瘤中的作用尚不清楚。本课题组前期研究发现，WTX在胃癌等多种肿瘤中低表达，但临床意义和分子机制不明。阐明WTX在胃癌进展过程中的作用及分子机制，可能为胃癌的防治提供新的理论基础及分子靶点。 MicroRNAs(miRNAs)是一类参与调节基因表达的非编码单链RNA分子，人体中至少有60％的基因受miRNAs的调控，胃癌中WTX基因失活是否受miRNA调控未见报道，MiRNA-WTX调控轴在胃癌发生发展中的作用及机制不清。 基于以上未知问题，本研究拟对WTX在胃癌组织中的临床病理学意义、细胞生物学功能及其作用机制、靶向WTX的miRNA的筛选及生物学功能等逐一进行探讨，以期揭示WTX在胃癌中的功能意义和临床应用价值。 目的: (1)分析WTX在胃癌组织中的表达及临床病理学意义; (2)探讨WTX对胃癌细胞生物学行为的影响及其分子机制; (3)筛选和鉴定靶向WTX的miRNAs并分析其临床意义及生物学功能; (4)构建miRNA-WTX-下游通路轴并阐明其作用机制和临床价值。 方法: (1)采用qRT-PCR、WesternBlot、免疫组化等方法从mRNA和蛋白水平分析胃癌组织样本中WTX的表达情况及临床病理学意义，再利用公共数据库资源加以分析验证。 (2)运用CCK-8、平板克隆形成、Transwell和划痕愈合等体外实验检测WTX对胃癌细胞生物学功能的影响;通过裸鼠皮下瘤、胃原位移植瘤模型整体水平分析WTX对肿瘤生长、成瘤、转移能力的影响。 (3)利用基因表达谱芯片筛选胃癌细胞中受WTX调控的基因，运用KEGG通路富集分析筛选下游通路，通过免疫共沉淀及蛋白表达分析进行初步验证。 (4)运用miRNAs芯片分析筛选靶向WTX的miRNAs，通过双荧光素酶报告系统、qRT-PCR、原位杂交(ISH)、WesternBlot和免疫荧光等技术，结合公共数据库GEO和TCGA的芯片数据资源加以分析验证，明确胃癌中靶向WTX的miRNA及其表达和临床意义。 (5)通过CCK8、平板克隆形成、划痕愈合、Transwell细胞迁移实验检测靶向WTX的miRNA的细胞生物学功能;通过裸鼠皮下荷瘤实验结合免疫组化和流式细胞术分析，整体水平验证其对WTX的调控作用、成瘤能力、肿瘤增殖和周期的影响。 (6)利用TCGA数据库资源进行生物信息学分析，运用WesternBlot、免疫组化和免疫荧光技术，明确胃癌中miRNA-WTX-下游通路轴的调控模式及分子机制。 结果: (1)WTX在胃癌中普遍低表达，与分化程度、淋巴结转移、组织学类型和临床预后密切相关。 (2)WTX可以与PI3K结合，负性调控PI3K/AKT/mTOR信号通路，抑制胃癌细胞的增殖、迁移、克隆形成和成瘤能力。 (3)MiR-20a-5p靶向WTX，促进细胞增殖、迁移、克隆形成和成瘤能力;促进胃癌细胞从G1期到S期转化，并抑制细胞凋亡。 (4)MiR-20a-5p通过靶向WTX调控PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进胃癌进展。 结论: WTX在胃癌中发挥抑癌基因功能;miR-20a-5p通过靶向WTX调节PI3K/AKT/mTOR信号通路，调控细胞周期和抑制细胞凋亡，从而促进胃癌细胞的增殖。MiR-20a-5p/WTX/PI3K/AKT/mTOR信号通路可能用于挖掘潜在的临床诊断分子标记物和治疗靶点。
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