摘要
研究背景及目的 子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是指功能性子宫内膜腺体及间质在宫腔外异位种植的疾病，可广泛累积女性生殖系统，包括子宫、卵巢、输卵管、盆腔等器官[1]。目前它的发病机制尚不明确，主要学说包括:异位种植学说（也称为经血逆流学说）、在位内膜决定论、体腔上皮化生学说和诱导学说、干细胞学说、遗传因素、免疫因素及环境因素和生活方式等[2]。 EMs作为一种常见的妇科疾病，可引起女性痛经、性交痛、不孕及慢性盆腔痛，对育龄期妇女的生殖健康产生了严重的不良影响。据报道，EMs中40％-60％有不孕，不孕症中约25％-40％为EMs，因此2000年国外学者首次提出“endometriosis-associatedinfertility”这一全新概念，即“子宫内膜异位症性不孕症”[3，4]。该病的临床治疗包括药物和手术治疗及辅助生殖技术，但存在费用高、妊娠率低等问题，严重降低患者的生活质量并影响其家庭生活。近年来，EMs发病率呈现上升趋势，已成为全球关注的重大公共卫生问题。就其根本原因在于EMs不孕的发生机理尚不清楚，难以从根本上解决此类患者的生殖健康问题。 上皮间质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞转变的现象，在此过程中，细胞经历细胞骨架重构后失去细胞极性、黏合连接、细胞桥接，由此获得迁移和侵袭能力等间质细胞特征[5-7]。以往研究发现，EMT和纤维化在内异症的发生中扮演重要角色，具体表现为子宫内膜上皮细胞的EMT促进内异症局部炎症损伤、修复、纤维化、细胞侵袭和转移;同时上皮细胞获得间质细胞样侵袭和运动能力，使得内异症虽为良性疾病却有恶性肿瘤侵袭和转移的特性。 晚期氧化蛋白产物(advancedoxidationproteinproducts，AOPPs)是体内蛋白质氧化终末期产物，可诱导EMT及纤维化发生，是许多慢性疾病的发病机制[8-11]。AOPPs在内异症子宫内膜上皮细胞的炎症损伤、修复、细胞侵袭和转移中发挥重要作用[12,13]。课题组前期研究表明，异常增高的AOPPs作为内源性致病物质，诱导体内外模型的子宫内膜上皮细胞增殖、迁移、氧化应激和炎症损伤。提示AOPPs与子宫内膜细胞功能紊乱发生有关，但AOPPs是否参与子宫内膜细胞EMT和纤维化过程，尚不清楚。因此，通过对AOPPs诱导的子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化进行深入研究，对发掘细胞功能紊乱过程中新的影响因子及其作用机制，阐明AOPPs致内异症发病机制提供新的理论依据并发展新的干预途径。 本研究拟通过检测AOPPs在EMs中的表达情况，分析其表达与EMT和纤维化指标之间的相关性，并通过体外及动物体内实验，研究AOPPs在EMs的EMT和纤维化过程中的作用及相关分子机制，为进一步阐明AOPPs致EMs发病的机制提供新的理论依据，对寻找干预EMs发病的靶标提供新思路。 研究方法 一、内异症疾病状态下，AOPPs与EMT和纤维化的关系研究 收集20例临床确诊为EMs患者的手术切除的异位子宫内膜标本和在位子宫内膜标本以及20例正常子宫内膜组织标本，利用免疫组织化学(Immunohistochemistry，IHC)检测在内异症的疾病状态下，卵巢异位囊肿、在位子宫内膜中AOPPs、EMT、纤维化指标的表达，并以正常妇女的子宫内膜组织做对照。 二、AOPPs对子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的影响及机制研究 1、AOPPs的制备及浓度测定，将鼠血清白蛋白(RatSerumAlbumin，RSA)与次氯酸钠混合孵育制备AOPPs，后测定AOPPs浓度、蛋白定量及内毒素的含量。 2、原代SD大鼠子宫内膜上皮细胞的提取、鉴定及培养，刮取8周龄SD雌性大鼠子宫内膜，经消化、过滤、裂解、过滤等步骤分离出子宫内膜上皮细胞，并采用免疫荧光试验以鉴定所提取细胞的种类和纯度，进行细胞培养。 3、外源性补充AOPPs，同时予氧化抑制剂刺激，利用免疫荧光技术及Westernblot技术检测子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化指标的变化。 4、外源性补充AOPPs后，利用Westernblot检测子宫内膜上皮细胞中ERK1/2、P38的表达，同时进行信号通路阻断实验，分析AOPPs调控子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的机理。 三、动物实验验证AOPPs在子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化发生中的作用 大鼠腹腔注射AOPPs4周、8周、12周后处死大鼠，取出子宫内膜组织，利用IHC检测EMT和纤维化指标，以进一步验证AOPPs介导了子宫内膜上皮细胞的EMT、纤维化过程。 研究结果 一、AOPPs与EMT和纤维化指标在EMs及正常女性组织中的表达鉴定 1、子宫内膜组织中AOPPs与EMT和纤维化指标的表达 IHC结果表明AOPPs在EMs组织中表达高，提示AOPPs参与EMs的发病过程，而在EMs组织中EMT相关指标E-cadherin表达下调、Vimentin表达上调，纤维化相关指标CollagenⅠ表达上调、组织中胶原纤维沉积增多，提示EMs与EMT及纤维化的发生有相关性。 2、AOPPs的表达和EMT及纤维化指标表达之间的关系 对IHC结果做统计分析，发现AOPPs与上皮细胞标志物呈负相关，与间质细胞标志物及纤维化标志物呈正相关，提示AOPPs可能通过EMT途径影响EMs相关纤维化及疾病进展。 二、AOPPs对子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的影响及机制研究 1、免疫荧光法鉴定所提取的细胞 所提取的原代大鼠子宫内膜细胞经细胞经免疫荧光鉴定，结果显示提取细胞表达角蛋白(Pan-Keratin)，波形蛋白(Vimentin)无表达，可认可为子宫内膜上皮细胞。 2、AOPPs诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化 免疫荧光实验及Westernblot结果表明，与对照组相比，AOPPs以浓度和时间依赖方式下调上皮细胞细胞标志性蛋白表达水平，同时上调间质细胞标志性蛋白和纤维化标志性蛋白表达水平，提示AOPPs能诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化改变。 3、AOPPs通过激活子宫内膜上皮细胞氧化应激反应诱导EMT的发生 Westernblot结果表明，与AOPPs组相比，氧化抑制剂预处理后上皮细胞标志性蛋白表达水平上调，而间质细胞标志性蛋白与纤维化标志性蛋白表达下调。上述实验提示氧化抑制剂能抑制AOPPs诱导的子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的发生，从而说明，氧化应激反应参与了AOPPs诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化的过程。 4、AOPPs通过激活MAPK通路诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化 Westernblot结果表明，与AOPPs组相比，AOPPs+MAPK通路阻断剂组上皮细胞标志性蛋白的表达水平上调，而间质细胞标志性蛋白与纤维化标志性蛋白表达下调。上述实验提示MAPK阻断剂能抑制AOPPs诱导的子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化的发生，从而说明，MAPK通路介导了AOPPs诱导子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化的过程。 三、动物实验验证AOPPs在子宫内膜上皮细胞EMT和纤维化发生中的作用 IHC实验结果表明，与对照组相比，AOPPs处理组大鼠子宫内膜的上皮细胞标志性蛋白的表达水平上调，而间质细胞标志性蛋白与纤维化标志性蛋白的表达下调，进一步证明了AOPPs可促进大鼠子宫内膜上皮发生EMT和纤维化。 结论 AOPPs与子宫内膜异位症的EMT及纤维化密切相关;AOPPs可通过激活大鼠子宫内膜上细胞的氧化应激，上调MAPK通路中的p-ERK与p-P38的表达，进而使大鼠子宫内膜上皮细胞发生EMT和纤维化，从而促进子宫内膜异位症的发生发展。
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