岩藻糖基转移酶2(Fut2)在炎症性肠病中的作用及机制研究

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中文摘要：目的：炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）是一种病因未明的肠道慢性疾病，根据临床特征可分为克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。近几十年来IBD在世界范围发病率有持续增高趋势。目前广泛认为其发病机制是由遗传因素、环境因素与肠道微生物等因素间复杂的相互作用导致的免疫失调和肠道炎症。人类全基因组研究数据显示岩藻糖基转移酶2（Fut2）可能与IBD的发生相关，但具体机制尚未明确，仍有待进一步探索。方法： 1.检测Fut2及岩藻糖基化在炎症性肠病患者肠道组织及葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的经典IBD模型小鼠肠道组织中的表达。 1.1收集克罗恩病和溃疡性结肠炎患者结肠活检组织标本，用实时定量PCR(real-time PCR)检测Fut2基因表达，用UEA-I荧光染色检测岩藻糖基化水平。 1.2建立体内模型，在野生型小鼠（WT）中使用DSS建立经典IBD模型，用real-time PCR、Western blot检测Fut2基因和蛋白表达，用UEA-I荧光染色检测岩藻糖基化水平。 2.检测肠上皮特异性Fut2基因敲除小鼠(Fut2△IEC)对结肠炎的影响。 2.1检测Fut2△IEC小鼠经过DSS诱导后结肠损伤情况。提取小鼠结肠上皮细胞，用real-time PCR、Western blot验证小鼠肠上皮Fut2敲除效果，用UEA-I荧光染色评估Fut2△IEC小鼠结肠岩藻糖基化表达量。给予3%DSS饮水7天构建小鼠IBD模型。 2.2检测Fut2△IEC小鼠经过DSS诱导后的肠道炎症反应情况。用real-time PCR、Western blot、免疫组织化学染色检测结肠组织炎症细胞分布及炎症因子表达情况。 2.3检测Fut2△IEC小鼠经过DSS诱导后肠屏障完整性。肠道黏液厚度用AB-PAS染色试剂盒进行检测。紧密连接蛋白使用real-time PCR免疫荧光染色、Western blot检测。 3.检测Fut2△IEC小鼠经过DSS诱导后肠道菌群变化及代谢产物变化情况。收集小鼠粪便，行16S rRNA测序及广泛靶向代谢组学检测，根据检测数据，利用生物信息分析，分析肠道菌群变化，寻找可能的重要代谢产物。 4.验证Fut2△IEC小鼠在IBD模型中肠道菌群改变对结肠炎的影响以及肠道菌群和代谢产物溶血磷脂酰胆碱LPC的关系。通过粪菌移植（Fecal microbiota transplantion，FMT）实验证实Fut2△IEC小鼠的肠道菌群影响代谢产物LPC的产生并加重DSS诱导的结肠炎。 5.验证LPC对结肠炎的影响。 5.1使用LPC灌肠处理小鼠7天，每天观察记录小鼠体重、大便性状及有无血便，评估疾病活动指数，测量结肠长度，用Hamp;E染色结肠炎症组织评分。 5.2检测LPC对肠道炎症反应的影响。用real-time PCR、Western blot，ELASE试剂盒检测结肠组织、细胞及上清炎症因子水平。 5.3检测LPC对肠道屏障的影响。用real-time PCR、Western blot，免疫荧光染色检测组织或细胞紧密连接蛋白的表达。用AB-PAS染色检测肠道黏液厚度。用电阻仪检测LPC处理后细胞跨膜电阻。结果： 1.与正常人相比，UC患者和CD患者病变结肠组织中的Fut2基因表达显著下调，肠道岩藻糖基化水平降低;IBD模型小鼠与正常小鼠相比，结肠组织中Fut2基因及蛋白水平显著下调，肠道岩藻糖基化水平也明显降低。 2.Fut2△IEC小鼠，与正常WT小鼠相比，经过DSS诱导后，结肠损伤明显加重，肠道炎症反应明显增强，肠屏障破坏更严重。 3.Fut2△IEC小鼠，与正常WT小鼠相比，经过DSS诱导后，肠道菌群多样性显著降低，菌群结构变化明显，粪便中代谢产物LPC明显升高。 4．与对照组相比，接受Fut2△IEC肠道粪便菌群的小鼠结肠损伤明显加重，肠道炎症反应明显增强，肠屏障破坏加重，且粪便中LPC浓度更高。 5.给予LPC干预组小鼠肠道损伤加重，肠道炎症反应明显增强，肠屏障功能显著下降。体外给予LPC干预的细胞，促炎因子分泌增加，屏障功能减弱。结论：本研究的实验结果表明，肠上皮细胞Fut2缺乏会影响肠道菌群的组成及功能，导致代谢产物LPC增加，从而促进IBD的发生发展。

作者：

唐雪莲

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关键词：

炎症性肠病发病机制岩藻糖基转移酶2 肠道菌群炎症反应免疫失调

授予学位：

博士

学科专业：

内科学(消化内科)

导师：

侯晓华

学位年度：

2021

学位授予单位：

华中科技大学

语种：

中文

中图分类号：