摘要
器官移植是治疗终末期器官衰竭的有效手段，移植排斥反应（Transplant rejection,TR）是移植术后常见的并发症及致死原因。TR的监测与治疗，是提高患者生存时间及生活质量的关键。然而，目前临床缺乏特异性强，敏感度高的TR无创监测手段与有效的靶向治疗方法。因此，亟待发展TR诊断治疗新方法。 研究表明，巨噬细胞可作为抗原呈递及效应细胞参与TR的发生发展，其在TR早期大量浸润，且移植物中巨噬细胞的浸润量与排斥反应的病理程度密切相关。基于此，我们认为巨噬细胞可作为早期诊断移植排斥反应靶细胞。此外，研究表明酵母菌提取物酵母微囊(Yeast capsules,YC)经口服后可模拟酵母菌胃肠道感染路径靶向巨噬细胞。因此，YC可作为靶向巨噬细胞的新型仿生载体。荧光成像具有快速、实时、灵敏、无辐射等优点，是一种理想的巨噬细胞成像手段。然而，传统的荧光染料存在聚集诱导淬灭，光稳定性差等缺陷，难以实现巨噬细胞的长期示踪。与传统染料相比，具有聚集诱导发光(Aggregation-induced emission，AIE)性质的荧光分子(luminogens,AIEgen）通常具有荧光量子产率高，光稳定性强等优势，有望实现细胞的长期示踪。基于此，我们提出：利用AIE分子可在YC的限域空间中聚集，构建仿生特性的AIEgen/YC，靶向示踪体内巨噬细胞，从而实现无创、实时监测排斥反应。 免疫抑制剂他克莫司(FK506)的应用可有效控制排斥反应，但长期服用会抑制患者的免疫系统，增加感染和诱发肿瘤的风险。如何在保证FK506疗效的同时减少其毒副作用，是临床面临的重大挑战。FK506主要通过抑制T细胞的增殖与活化治疗TR，而淋巴结是T细胞增殖与活化的主要场所，这提示我们如果将FK506靶向递送至淋巴结可增强FK506的疗效并减少其毒副作用。前期研究发现YC被巨噬细胞吞噬后可定向迁移至淋巴结和移植物，基于此，我们认为以YC为仿生载体将FK506高效递送至淋巴结可有效抑制TR。 因此，本研究旨在构建酵母微囊仿生体实现移植排斥反应的诊断及治疗。 第一部分 酵母微囊的制备及性质研究 目的：制备酵母微囊(YC)并表征其基本性质。 方法：①以酵母菌为原料，通过热酸碱有机溶剂法提取YC；②利用电子显微镜、红外光谱仪、热重分析仪、激光共聚焦显微镜等手段对其表征；③分析血常规指标、肝肾功能主要指标、主要器官（心、肝、脾、肺、肾）HE染色初步评估YC安全性。 结果：①电镜结果显示酵母菌内容物大部分被去除，YC呈皱缩形貌且表面具有孔洞结构，粒径约为3.74μm；②YC主要由β-1,3-D葡聚糖组成；③与对照组相比，YC组老鼠肝肾功能指标(谷丙转氨酶ALT，谷草转氨酶AST，肌酐CR，尿素氮BUN)没有显著性变化；④血常规结果显示YC未造成白细胞、淋巴细胞、单核细胞等血细胞数目增加；⑤HE染色结果显示主要器官组织结构正常，无明显组织损伤。 结论：成功制备中空表面带孔，主要成分为β葡聚糖，生物安全性良好的YC，为构建诊断治疗排斥反应的仿生酵母微囊递送系统奠定了良好基础。 第二部分 酵母微囊仿生型聚集诱导发光探针监测移植排斥反应 目的：构建仿生型聚集诱导发光探针(AIEgen/YC)，原位追踪皮肤移植小鼠体内巨噬细胞，实时、无创监测排斥反应进程。 方法：①在课题组已成功合成AIEgen（HBTTPIP，HBTTPAP，HBTTPEP）的基础上，构建AIEgen/YC，采用TEM、CLSM、高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)、荧光分光光度计等对其表征，并通过分子动力学模拟实验研究AIEgen与YC主要成分β-葡聚糖的相互作用；②通过TEM，CLSM及流式细胞术（Flow cytometry,FCM）对巨噬细胞识别YC进行定性与定量分析，并对其靶向机制进行研究；③以巨噬细胞吞噬率及迁移率为评价指标分析AIEgen/YC对巨噬细胞生物学功能的影响；④通过CCK-8试剂检测AIEgen/YC的细胞毒性；⑤构建小鼠背部皮肤移植模型，通过视诊，病理分析等，判断模型是否成功建立；⑥通过研究T细胞及巨噬细胞数量与荧光强度之间的相互关系，研究巨噬细胞与排斥反应的相关性；⑦口服AIEgen/YC，利用小动物活体成像设备进行排斥反应早期诊断及动态监测；⑧口服AIEgen/YC，评估FK506治疗后移植物排斥程度。 结果：①成功制备稳定性良好的AIEgen/YC，共聚焦显微镜显示AIEgen被高效负载至酵母微囊中，高效液相结果显示HBTTPIP，HBTTPAP，HBTTPEP与YC的结合率分别为79.0%，86.9%，91.6%。②共聚焦，电镜及分子动力学结果表明AIEgen能够进入YC空腔且结合在β-葡聚糖壳上。③细胞实验结果表明AIEgen/YC能被巨噬细胞特异性识别并吞噬，吞噬率接近100%，且不影响巨噬细胞生物学功能；④TEM及CLSM结果显示AIEgen/YC能够稳定存在于巨噬细胞中至少1周；⑤成功构建小鼠背部皮肤移植模型，手术成功率95%以上；⑥同种异体移植皮中巨噬细胞数量与排斥程度成正相关，可作为早期诊断排斥反应的标志物之一；⑦移植术后3d口服AIEgen/YC，可观察到同种异体移植物荧光信号，表明其能够早期诊断移植排斥反应；⑧术后当天口服AIEgen/YC，不同时间点的观察，结果显示移植皮荧光强度随排斥程度增加而增加，表明其具有动态监测移植排斥反应的能力；⑨经FK506治疗后，移植皮荧光强度显著降低，表明其具有疗效评估的功能。 结论：首次发现阳离子型AIEgen可在YC的微尺度限域空间中聚集并激活荧光发射，口服后被巨噬细胞高效吞噬，并随巨噬细胞靶向迁移至移植物。单次口服AIEgen/YC可用于监测排斥反应的进展及评估免疫抑制治疗的预后，这项工作为体内巨噬细胞的追踪和排斥反应无创监测提供了一种新策略。 第三部分 酵母微囊靶向递送FK506治疗移植排斥反应 目的：构建仿生酵母微囊靶向递送FK506体系(FK506/YC)，靶向递送FK506至淋巴结，评估该体系治疗心脏移植排斥反应效果。 方法：①通过自沉积方法制备FK506/YC；②利用HPLC测定其浓度，计算包封率,并通过TEM、SEM和粒径分析仪对其表征；③通过模拟胃肠道环境，采用离心法研究FK506/YC的体外释药特性；④构建大鼠腹腔异位心脏移植模型，通过视诊、触诊等方法对模型成功率进行评估；⑤分别灌胃给予模型鼠PBS，YC，不同剂量FK506及FK506/YC，术后第7d收集移植心，进行HE染色、免疫组化染色及免疫荧光染色；⑥大鼠口服不同FK506制剂，7d后收集血液及肾脏组织，进行肾功能指标测定及HE染色；⑦大鼠口服荧光探针标记的YC，采用活体成像、CLSM等方法对小肠集合淋巴滤泡、肠系膜淋巴结中荧光探针的分布进行分析，探索YC的口服路径。 结果：①成功制备FK506/YC，其粒径约为3.56μm，包封率80%左右，释药结果显示24h约有60%药物释放；②口服FK506/YC24h后，淋巴结内FK506的含量显著高于FK506；③成功构建大鼠腹腔异位心脏移植模型，手术成功率90%以上；④FK506/YC能够显著延长移植心的生存期（平均生存时间，17.8±1.9versus7.3±1.0天，P＜0.01）；⑤术后第7天，FK506/YC治疗组移植心组织病理学表现与同基因移植心类似，显示炎性细胞浸润显著降低且无明显心肌细胞坏死，此外，结果显示FK506/YC组与其它治疗相比移植心处CD3+T细胞浸润量，IL-2及IFN-γ分泌量显著降低；⑥FK506/YC组与正常组相比，肾功能指标均无明显变化，且肾脏结构无明显异常；⑦酵母微囊能够从派氏淋巴结转移至肠系膜淋巴结，并可在肠系膜淋巴结积累。 结论：FK506/YC通过靶向递送FK506至淋巴结及移植心，显著延长移植物生存期，能够在保证疗效的同时减少不良反应。此外，FK506/YC制备工艺简单，易于临床转化，且FK506/YC具有广谱性，有望为治疗自身免疫性疾病提供新方法。
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