摘要
研究目的： 评估胆道闭锁（biliary atresia，BA）中血清基质金属蛋白酶7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7）的动态变化及在诊断和判断预后中的价值；初步阐明MMP-7基因多态性对血清MMP-7水平的影响；动物实验研究中和MMP-7对BA的治疗价值。 研究方法： 胆道造影检查作为诊断BA的金标准，选择BA组和非BA的胆汁淤积症（non-biliary atresia-related cholestasis，Non-BA）组进行血清MMP-7的检测，评价血清MMP-7诊断BA的价值。预计血清MMP-7诊断BA的灵敏度为87%，灵敏度的容许误差为5%；特异度为90%，特异度的容许误差为10%；选取置信度1-α=0.95。BA组和Non-BA组采用相等的样本量，利用PASS15软件计算，需要纳入193例BA患者和193例Non-BA患者。2017年9月至2020年6月在国内4个中心招募到403名胆汁淤积症（直接胆红素水平＞17μmol/L）患者，其中21例拒绝做血清MMP-7检测，其余382例（武汉协和医院136例、西安儿童医院125例、武汉儿童医院45例和深圳儿童医院76例）被纳入本研究。排除标准包括拒绝做MMP-7检测和在MMP-7检测前已知胆汁淤积的具体病因。患者入组后，采集年龄、性别等基本信息和相关病史、实验室检查结果，并在武汉协和医院进行血清MMP-7检测。每个患者的最终诊断都是由儿科肝病专家和儿外科医生共同作出的。肝门空肠吻合术（hepatoportoenterostomy，HPE）术后1周、2周、4周、6周、8周、10周、3月（12周）、6月（25周）、9月（38周）和12月（52周）常规随访。每次随访BA患者均检测其血清MMP-7水平。随访终点为死亡、肝移植或HPE术后1年内自体肝生存。从所有患者的父母处获得参与研究的知情和书面同意，获华中科技大学同济医学院伦理委员会批准（编号：2020S029）和中国临床试验注册中心批准（编号：ChiCTR1900028456）。应用Sanger法检测部分患儿全血中MMP-7的外显子和启动子区域；部分肝组织行免疫组织化学染色观察MMP-7的表达和分布。RT-qPCR检测肝脏组织MMP-7基因的mRNA的表达水平。 轮状病毒（Rhesus rotavirus，RRV）建立BA动物模型。新生的Balb/c的小鼠随机地分为4组：①正常组：在出生12小时内，新生的Balb/c小鼠腹腔注射25μL培养基，作为对照；②RRV组：在出生12小时内，新生的Balb/c小鼠腹腔注射RRV（25μL，1×106PFU），从而建立BA模型；③MMP-7对照组：在出生12小时内，新生的Balb/c小鼠腹腔注射RRV，并在出生后的第1?5天注射10μL的PBS；④MMP-7干预组：在出生12小时内，新生的Balb/c小鼠腹腔注射RRV，并在出生后的第1?5天注射MMP-7抗体（10μL，1μg/μL）。四组小鼠于出生后的第7天、14天留取血标本及肝脏标本。在不同时期，观察四组小鼠一般的生理状态、陶土色大便发生率、黄疸率和总体生存率。组织学评估BA小鼠肝脏组织的炎症浸润程度。ELISA检测血清中MMP-7的含量；RT-qPCR检测肝脏组织MMP-7基因的mRNA水平。 计量资料用中位数（四分位距InterQuartile Rang，IQR：第一四分位数Quartile，Q1，第三四分位数Q3）或平均值?标准误表示，用SPSS26.0、Graphpad prism6.0和Image Pro plus软件对数据进行统计分析，Mann-Whitney U检验（非参数检验）对数据进行分析、检验，两组率的检验采用卡方检验或Fisher检验，并用P＜0.05行显著性检验。 研究结果： 一、（1）血清MMP-7水平动态变化及其意义：BA组血清MMP-7水平67.26ng/mL（IQR：48.02，100.60）明显高于Non-BA组12.52ng/mL（IQR：8.12，18.71）（P＜0.0001）。血清MMP-7诊断BA的临界值为35.76ng/mL（敏感性为97.40%，特异性为93.68%，AUC为0.9723）。血清MMP-7水平＞35.76ng/mL诊断BA的阳性预测值、阴性预测值和诊断效率分别为97.31%、93.94%和95.61%。年龄组分析显示：年龄61～90天及90天以上的BA患者血清MMP-7水平明显高于年龄≤28天的BA患者。年龄≤28天的BA患者和年龄29～60天的BA患者的血清MMP-7水平无显著性差异。然而，MMP-7在Non-BA患者中的水平没有随年龄增长而变化。（2）HPE术后血清MMP-7的动态变化为血清MMP-7水平在术后1周先下降，之后升高，直到第4周，自体肝生存组（native liver survival，NLS）的血清MMP-7开始逐渐降低，而肝移植组（liver transplantation，LT）的血清MMP-7越来越高。ROC曲线分析：BA患儿HPE术后3月，血清MMP-7预测患者需要肝移植的临界值为56.68ng/mL（敏感性为95.74%，特异性为86.79%，AUC为0.9422）。（3）BA组的肝组织MMP-7基因的mRNA水平是Non-BA组4.38?0.58倍。（4）血清MMP-7水平的Spearman相关性分析结果为：血清MMP-7水平与纤维化分期、炎症分级、总胆红素（total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（direct bilirubin，DBIL）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、γ-谷氨酰转肽酶（gamma glutamyl transpeptidase platelet，γ-GT）均呈正相关。血清MMP-7水平的多元线性回归模型结果为：炎症分级、γ-GT和纤维化分期是影响血清MMP-7水平的重要因素。 二、MMP-7基因多态性：为了评估本研究中小部分患者MMP-7血清水平低的原因，我们对MMP-7的外显子和启动子区域进行了多态性测序。低血清MMP-7（≤35.76ng/mL）BA患者组第3外显子c.410G/A(rs17884789)杂合突变率显著高于高血清MMP-7（＞35.76ng/mL）BA患者组（P=0.010）。 三、动物模型中：小鼠出生后第7天，RRV组的血清MMP-7比正常组高（2.24±0.40ng/mL vs1.01±0.13ng/mL,P=0.0186）；MMP-7干预组血清MMP-7比MMP-7对照组低（1.23±0.12ng/mL vs2.21±0.28ng/mL,P=0.0118）。第14天，RRV组的血清MMP-7比正常组高（3.76±0.85ng/mL vs1.39±0.27ng/mL,P=0.0284）；MMP-7干预组血清MMP-7比MMP-7对照组低（1.59±0.17ng/mL vs3.71±0.68ng/mL,P=0.0161）。通过动物干预实验，我们发现MMP-7抗体干预后的小鼠与MMP-7对照组相比，黄疸率和陶土色大便发生率均下降显著，肝脏组织中的炎症程度明显减轻，死亡小鼠出现的时间延后、总体生存率有明显上升。 研究结论： 一、多中心前瞻性研究发现血清MMP-7水平可以用于BA的早期诊断,影响血清MMP-7水平的重要因素是炎症分级、γ-GT和纤维化分期； 二、HPE术后3月时，血清MMP-7＞55.68ng/mL患儿的肝移植概率明显高于血清MMP-7水平≤55.68ng/mL的患儿； 三、第3外显子c.410G/A(rs17884789)突变使MMP-7表现为膜型（优先位于细胞膜），从而导致血清中MMP-7水平低； 四、中和MMP-7可以减轻胆管损伤，降低小鼠的黄疸率，延长生存期，为将来胆道闭锁的治疗提供了新靶点。
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