摘要
本文主要从以下几方面进行论述： 第一部分 Piezo1对肠上皮屏障功能的调节作用 目的：研究Piezo1在肠上皮细胞中的表达及对肠上皮屏障功能的影响。 方法：采用慢病毒包装Piezo1shRNA和sgRNA，感染Caco-2细胞，使其低表达和过表达Piezo1基因，干预Caco-2细胞系，分为四组：Piezo1-KD干预组、Piezo1-OV干预组，CON-KD干预组和CON-OV干预组，通过免疫荧光、RT-PCR和Western Blot分别检测Piezo1、Claudin-1、Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表达水平。将Caco-2细胞接种于Transwell板构建体外上皮屏障模型，分别用Piezo1激动剂（Yoda1）和抑制剂（钌红、GsMTx4），干预Caco-2细胞系和小鼠结肠上皮，分为四组：对照组，钌红（RuR）处理组（6μg/ml），GsMTx4处理组（2μg/mL）和Yoda1处理组（1μg/mL）。采用Ussing chamber分别测定Caco-2细胞构建的体外上皮屏障和小鼠结肠粘膜层的跨膜电阻（TEER）及其对异硫氰酸荧光素-右旋糖苷（FITC-dextran）的通透能力。 结果：1.Piezo1在Caco-2细胞和小鼠结肠上皮细胞中有明显的表达，主要位于细胞膜。2.慢病毒包装Piezo1shRNA和sgRNA感染Caco-2细胞后，能显著降低和增加Piezo1的表达（P＜0.05，P＜0.05）；Piezo1低表达组（Piezo1-KD）较对照组TEER值更高（492.68±23.39vs.431.85±27.56Ω，cm2，n=6，P=0.003），FITC-葡聚糖透过率无显著性差距（0.45±0.02vs.0.44±0.02ng×mL-1cm-2min-1，n=6，P=0.085）。Piezo1过表达组（Piezo1-OV）组TEER值有明显降低（224.68±22.24vs393.05±44.00Ω×cm2，n=6，P＜0.001），FITC-葡聚糖透过率增加（0.45±0.02vs.0.44±0.02ng×mL-1cm-2min-1，n=6，P=0.085）。Piezo1低表达组（Piezo1-KD）Claudin-1表达增加（n=6；P=0.024，P=0.0006），在Piezo1过表达组（Piezo1-OV）中Claudin-1的mRNA及蛋白表达显著下降（(n=6；P=0.016，P＜0.001）。Piezo1-OV组中Occludin表达增加(P=0.002)。Piezo1-KD组中Occludin mRNA和蛋白表达无明显差异（n=5；P=0.431，P=0.474），Piezo1-KD组和Piezo1-OV组ZO-1mRNA和蛋白表达无明显变化(n=6；P=0.079，P=0947)。在Caco-2细胞中，Piezo1与Claudin-1存在共定位。3.Piezo1抑制剂RuR和GsMTx4抑制Piezo1通道开放后，与对照组相比，TEER值升高（426.0±6.19and428.27±6.74vs432.0±5.42Ω×cm2，n=6；P=0.027，P=0.006）。GsMTx4抑制Piezo1通道开放后，FITC-葡聚糖透过率较对照组下降（0.44±0.03vs0.53±0.02ng×mL-1cm-2min-1，n=6，P=0.03）。Yoda1激活Piezo1通道开放后，与对照组相比，TEER显著下降，FITC-葡聚糖透过率增加（78.90±2.88vs54.00±3.57Ω×cm2，n=5，P=0.006）。小鼠肠道组织中，Yoda1激活Piezo1通道开放可以显著降低TEER(78.90±2.88vs54.00±3.57Ω×cm2，n=5，P=0.006)，FITC-葡聚糖透过率增加（0.64±0.03ng×ml-1cm-2min-1，n=6，P＜0.001）。 结论：Piezo1蛋白活化和表达参与调节肠上皮屏障功能，并且Piezo1可以通过影响Claudin-1和Occludin的表达来调控上皮屏障。 第二部分 Piezo1通过ROCK1/2通路参与调节肠上皮屏障功能 目的：研究ROCK1/2通路在Piezo1调节肠上皮屏障功能中的作用； 方法：采用慢病毒包装Piezo1shRNA和sgRNA，感染Caco-2细胞分别低表达和过表达Piezo1，采用ROCK1/2抑制剂Y-27632、ROCK1/2激动剂U-46619干预Caco-2细胞，分为八组：CON-KD干预组，PIEZO-KD干预组，CON-KD+Y-27632干预组，Piezo1-KD+Y-27632干预组；CON-OV干预组，Piezo1-OV干预组，CON-OV+U46619干预组，Piezo1-OV+U46619干预组。应用免疫荧光、RT-PCR和Western Blot检测Claudin-1、ZO-1、Occludin的mRNA和蛋白表达。应用RT-PCR和Western Blot检测ROCK1/2、Erk1/2的表达。 结果：1.Piezo1-KD组中Caco-2细胞ROCK1和ROCK2表达增加（n=5，6；P＜0.001，P＜0.001），Piezo1-OV组中则表达下降（n=5，6；P=0.002，P=0.003）。Piezo1-KD组中磷酸化的Thr455/Ser456ROCK1和Ser1366ROCK2表达增加（n=6；P=0.034，P＜0.001）Piezo1-OV组中表达下降（n=6；P=0.035，P=0.003）。Piezo1-KD和Piezo1-OV组中Erk1/2的表达则无显著差异（n=6；P=0.952，P=0.923）。2.Piezo1-KD组，ROCK1/2抑制剂Y-27632显著降低Claudin-1的表达（n=6，P＜0.001），ROCK1/2激动剂U-46619干预后的CON-OV组Claudin-1较CON-OV组无明显改变（n=6，P=0.074）。同时，U-46619可升高Piezo1-OV组中Claudin-1的表达（n=6，P＜0.001）。3.ROCK抑制剂Y-27632和ROCK激动剂U-46619分别干预CON-KD组，Piezo1-KD组，CON-OV组和Piezo1-OV组后Occludin及ZO-1的表达无明显变化(P＞0.05)。 1Piezo1调控下游ROCK1/2通路的表达 2干预ROCK1/2可以逆转Piezo1对紧密连接蛋白Claudin-1的影响。
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