MafK在鼠伤寒沙门菌感染中的作用及机制的研究

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MafK在鼠伤寒沙门菌感染中的作用及机制的研究

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中文摘要：沙门菌是目前世界范围内最重要的食源性病原菌之一，能够感染人和多种动物，引起很高的发病率和死亡率，对畜牧业的发展和人类的健康构成严重的威胁。抗生素是其治疗的主要手段，但是由于药物残留及细菌耐药性等问题日益严重，急需寻找更安全、有效的沙门菌病治疗策略。肠屏障是抵御肠道病原菌入侵的重要防线，其功能的完整在防止沙门菌入侵起到重要作用。肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物K（v-mafavianmusculoaponeuroticfibrosarcomaoncogenehomologK,MafK）是Maf家族中的小Maf蛋白之一。有研究表明，MafK在溃疡性结肠炎患者结肠组织中高表达，提示MafK可能参与调控肠屏障功能。然而，MafK是否能调控肠屏障功能、其通过什么机制调控肠屏障功能、以及其是否能够通过调控肠道屏障功能来促进或限制沙门菌感染，目前尚未见报道。因此，本研究以MafK过表达转基因（MafKTg）小鼠、野生型（WT）小鼠和人结肠癌细胞系（Caco-2）为研究对象，利用鼠伤寒沙门菌建立动物和细胞感染模型，从调控肠屏障功能角度，系统研究了MafK在鼠伤寒沙门菌感染所致肠炎中的作用及其机制。首先利用WT和MafKTg小鼠构建沙门菌感染性肠炎模型，分析MafK过表达小鼠对沙门菌易感性的影响。通过检测沙门菌黏膜感染后WT和MafKTg小鼠的存活率以及盲肠病理组织学变化等，发现MafKTg小鼠的存活率更低、体重下降更多，在沙门菌感染48h后，脾脏肿大更明显、盲肠重量更低，杯状细胞减少更显著，肠上皮完整性破坏和肠道黏膜下层水肿更明显；利用ELISA、westernblot等检测促炎介质蛋白水平变化，发现MafKTg小鼠盲肠中促炎介质水平更高；通过检测MafKTg小鼠中体内各个器官的沙门菌荷菌数，发现MafK能够促进沙门菌定殖与扩散。这些结果表明MafK增加小鼠对沙门菌黏膜感染的易感性。为了研究MafK是否通过调控肠屏障功能来影响鼠对沙门菌黏膜感染的易感性，利用免疫荧光、westernblot和荧光定量PCR等方法检测了肠屏障相关紧密连接蛋白水平变化，结果发现，在沙门菌感染48h后，MafKTg小鼠盲肠中claudin3mRNA和蛋白水平下降更明显，而occludin和ZO-1的mRNA表达水平没有变化；利用免疫组织化学的方法检测盲肠组织中mucin2的蛋白水平，结果发现，在沙门菌感染48h后，MafKTg小鼠盲肠中mucin2蛋白水平减少更明显；利用免疫荧光、TUNEL染色等检测盲肠上皮细胞增殖和凋亡的情况，发现与WT小鼠相比MafKTg小鼠肠上皮细胞的增殖水平变化不显著，而凋亡细胞数显著增加，沙门菌感染48h后，MafKTg小鼠中活化的caspase-3显著增加，这可能是MafKTg小鼠表现出过度炎症的原因。随后检测了尚未出现明显炎症和组织损伤情况下caspase-3的活化情况，结果发现，沙门菌感染6h后，感染早期MafKTg小鼠中活化的caspase-3显著增加；利用高通量测序检测了肠道菌群变化情况，结果发现MafKTg小鼠与WT小鼠肠道菌群多样性没有显著变化。这些结果提示MafK可能主要通过调控肠上皮细胞凋亡来影响肠屏障功能。为了进一步研究MafK调控肠屏障功能的机制，利用westernblot和免疫共沉淀等检测沙门菌感染前后MafK过表达或MafK沉默肠上皮细胞系Caco-2中NF-κBp65核转位、MafK与NF-κBp65互作及cleavedcaspase-3水平变化，结果发现MafK过表达增加NF-κBp65核转位、MafK与NF-κBp65互作及cleavedcaspase-3水平，MafK沉默后能消除上述现象。这些结果表明MafK通过NF-κBp65途径和活化caspase-3，促进早期肠上皮细胞的凋亡。以上结果表明，MafK通过NF-κBp65途径和活化caspase-3促进肠上皮细胞凋亡以破坏肠屏障完整性，进而增加小鼠对沙门菌黏膜感染的易感性。因此，MafK有望成为防治沙门菌病的有效干预靶标。

作者：

徐诗瑶

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关键词：

沙门菌肠炎 MafK细胞细胞凋亡 caspase-3细胞 NF-κBp65 耐药性

授予学位：

博士

学科专业：

基础兽医学

导师：

柳巨雄

学位年度：

2022

学位授予单位：

吉林大学

语种：

中文

中图分类号：

R3