摘要
我国是世界上鸭养殖规模最大的国家，近些年有关报道显示鸭的沙门氏菌感染率呈逐渐上升趋势，这给我国养鸭业带来了严重的经济损失。沙门氏菌在鸡、鸭等禽类动物中可以通过水平和垂直两种方式传播，不仅传播速度快，而且成年动物隐性传播风险高，防控难度大。为了实现鸭群沙门氏菌污染情况的精准评估，提供沙门氏菌防控和净化的可靠依据，促进养鸭业健康发展。本研究通过生物信息学分析筛选出一种在沙门氏菌属内保守，属间特异的蛋白PagN，并将其在体外高纯度表达。基于重组PagN蛋白建立间接ELISA方法用于鸭源沙门氏菌的抗体检测。 1.目的蛋白筛选 本研究通过生物信息学和遗传进化分析，成功筛选到靶蛋白PagN。该蛋白为沙门氏菌的外膜蛋白，通过BLASTN比对发现PagN基因在沙门氏菌属内的同源性可达98%以上，与其它非沙门氏菌的同源性在50%以下。DNAStar软件预测显示PagN蛋白的β-转角和无规卷曲所占比例相对较大，具有较好的亲水性、柔韧性、免疫原性、表面可能性。抗原表位预测显示该蛋白的胞外环区域分布4个抗原性较强的抗原表位，可刺激机体产生特异性抗体用于血清学检测。 2.PagN蛋白的重组表达 本研究通过PCR扩增得到PagN基因完整核酸序列，并将其克隆至pET-32a(+)中成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-PagN。酶切验证和测序比对正确的重组质粒转入E.coilBL21中诱导表达。使用终浓度为1mM的IPTG，在37℃，220rpm诱导表达6h。SDS-PAGE分析表明该蛋白为43kDa，且以包涵体的形式表达。使用尿素将包涵体变性后采用亲和层析对重组PagN蛋白进行纯化，纯化后采用梯度透析去除尿素以恢复其正常的生物学活性，测定其蛋白终浓度为1.052mg/mL。通过SDS-PAGE和Westernblot分析表明重组PagN蛋白具有较好的反应原性，具备作为间接ELISA诊断蛋白的能力。 3.基于重组PagN蛋白的间接ELISA检测方法的建立 本研究基于重组PagN蛋白初步建立间接ELISA检测方法，通过大量摸索确定最适反应条件：1μg/mL抗原37℃包被2h；5%脱脂奶粉37℃封闭2h；待检血清1∶50稀释，37℃孵育30min；酶标二抗1∶4,000稀释，37℃孵育90min；TMB底物反应20min。使用此方法对38份沙门氏菌阴性血清样本进行检测，根据统计学原理确定其Cut-off值为0.268。用该方法检测肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和科特布斯沙门氏菌的阳性血清结果均为阳性；与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌抗体无交叉反应。对沙门氏菌阳性血清的最低检测限度为1∶1,600。批内和批间重复试验的变异系数均在10%以下。该方法与Dot-blot进行平行检测，总符合率为89%（89/100）。使用该方法对山东地区3个不同养鸭场的临床血清样本进行检测，总体阳性率为44.86%。本研究建立的基于重组PagN蛋白的间接ELISA检测方法灵敏度高，特异性强，且适用于主要血清型的沙门氏菌，为鸭源沙门氏菌临床检测提供了新的研究方向，为抗体检测试剂盒的开发提供了可靠的技术支持。
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