摘要
目的： 探讨阿里红多糖组分对APP/PS1双转基因小鼠和Aβ25-35诱导的PC12细胞的线粒体损伤和氧化应激通路的作用及保护机制。 方法： 1．Aβ25-35诱导PC12细胞，模拟阿尔茨海默病（Alzheuner’sdisease，AD）的细胞模型。检测阿里红多糖组分对AD模型细胞增殖的保护作用，确定实验浓度。将PC12细胞分为正常组、模型组（加40μmol/LAβ25-35）、阳性组（加50μmol/L盐酸多奈哌齐）、不同浓度的FOPSa和FOPSb干预组观察细胞凋亡形态学变化，流式细胞术检测细胞凋亡率的变化；检测两种阿里红多糖组分对各组细胞培养液中超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdedhde，MDA）、乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）、线粒体膜电位（Mitochondrialmembranepotential，MMP）和腺苷三磷酸（Adenosinetriphosphate，ATP）的含量变化；测定与线粒体凋亡密切相关的细胞色素C的表达量。以靶向探针追踪Aβ25-35在PC12细胞中的亚细胞定位情况；通过试剂盒检测PC12细胞中活性氧自由基ROS的变化；Westernblotting法测定细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达量以及和氧化应激相关的核相关因子2（Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）通路中的Nrf2、细胞凋亡信号调节激酶1（Apoptosissignal-regulatingkinase1，ASK1）和磷酸化的ASK1蛋白的表达情况。 2．选用3月龄雄性APP/PS1双转基因小鼠及相同月龄野生雄性C57小鼠作为正常组。将APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、多奈哌齐组（剂量：0.65mg/kg）、阿里红多糖组分FOPSa和FOPSb低、中、高剂量组（15、30、60mg/kg），每组8只，对小鼠实施灌胃治疗，连续给药3个月，模型组和正常组灌胃等体积的生理盐水。采用Morris水迷宫法和跳台实验测定小鼠行为学和学习记忆能力；采用刚果红染色法观察小鼠大脑皮层和海马组织中的病理学变化；试剂盒法测定小鼠脑组织中SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase，GSH-Px）活力、丙二醛含量以及ATP的含量。采用免疫印迹法检测各组细胞核内转录因子（CREB）和PGC-1α蛋白的表达水平。 3．将PC12细胞分为空白组、模型组（加40μmol/LAβ25-35）、高浓度的FOPSa和FOPSb干预组（各200μg/mL），应用全转录组测序技术筛选阿里红多糖组分FOPSa和FOPSb给药组与AD模型中具有显著性表达差异的基因，并用GO数据库（Geneontologydatabase）和KEGG数据库（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomesdatabase）分析与线粒体损伤和氧化应激相关的基因功能和信号通路，从基因水平预测阿尔茨海默病发病的分子机制。 结果： 1．两种阿里红多糖组分给药组均对损伤的PC12细胞的存活率有显著性提高。阿里红多糖组分在200μg/mL时可明显降低模型细胞培养液中MDA、LDH含量，提高SOD活力；Aβ25-35诱导PC12细胞后，通过不同剂量FOPSa及FOPSb干预，能明显改善Aβ25-35对PC12细胞造成的损伤，与模型组比较，FOPSa及FOPSb可提高细胞存活率。流式细胞术实验结果显示：与空白组比较，模型组细胞凋亡量增加，与模型组比较，FOPSa及FOPSb均能显著改善细胞凋亡程度。Aβ25-35处理PC12细胞会影响线粒体的完整性，在200μg/mLFOPSa/b预处理PC12细胞后，能够显著缓解Aβ25-35对线粒体的损伤，同时使Aβ25-35的亚细胞共定位减弱；与空白组比较，模型组细胞中ROS含量增加，与模型组比较，FOPSa及FOPSb干预组均能降低ROS的沉积，差异有统计学意义；Westernblotting结果显示：与模型组比较FOPSa及FOPSb均能减少APK1的磷酸化水平，上调Nrf2的蛋白表达水平。 2．Morris水迷宫实验结果显示：与模型组相比，阿里红多糖组分干预组小鼠逃避潜伏期明显缩短，目标象限滞留时间明显延长，小鼠穿越平台次数明显增加；跳台实验结果显示：与模型组比较，阿里红多糖组分给药组逃避潜伏期明显延长，跳台错误次数明显降低；刚果红染色结果表明，与正常组相比，模型组小鼠大脑皮层和海马组织中淀粉样斑块明显增多，与模型组比较，阿里红多糖组分给药组能不同程度减少APP/PS1小鼠大脑皮层及海马神经中淀粉样斑块的沉积；另外，与模型组比较，阿里红多糖组分能明显增加APP/PS1小鼠脑组织中SOD、GSH-Px酶活性及ATP的含量，明显降低MDA含量；Western-blot法结果显示，与模型组比较，阿里红多糖低、中、高剂量给药组小鼠脑内CREB和PGC-1α蛋白表达量明显上调。 3．测序结果显示阿里红多糖组分FOPSa及FOPb作用于AD细胞后，对细胞中调控线粒体和氧化应激的部分基因具有一定的影响：mRNA水平的GO功能富集分析中，确定了与线粒体和氧化应激相关的11个有效GO条目，主要涉及线粒体运输，线粒体复合酶链式反应Ⅱ，线粒体膜结构和氧化应激调控等方面。LncRNA水平的GO功能富集分析中，确定了与线粒体和氧化应激相关的1个有效GO条目，涉及氧化应激反应中RNA聚合酶Ⅱ的转录与调控。 结论： 1．证实阿里红多糖组分FOPSa和FOPSb能够缓解因Aβ25-35诱导PC12细胞造成其线粒体损伤和产生一系列氧化应激反应的细胞毒性。荧光探针追踪Aβ25-35的作用部位，发现其可进入到PC12细胞的线粒体中，并且阿里红多糖组分能够通过激活Nrf2信号通路显著改善Aβ25-35对PC12细胞线粒体的损伤。 2．阿里红多糖组分可提高APP/PS1双转基因小鼠行为学和学习记忆能力，可通过抑制APP/PS1双转基因小鼠大脑皮层和海马中淀粉样斑块的形成，而减少Aβ对神经元的毒性损伤，增加抗氧化酶的活性，降低脂质过氧化产物的含量，并通过参与线粒体和氧化应激通路对APP/PS1小鼠进行神经保护。 3．转录组结果预测得到两种阿里红多糖组分能通过调节多个基因及多个信号通路的活性参与产生AD的生物学过程，其中涉及到阿里红多糖组分参与细胞凋亡、线粒体损伤和氧化应激等途径，为今后进一步研究AD发病的分子机制打下了基础。
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