摘要
目的：牵张成骨技术因其独特的可同时诱导内源性骨和软组织再生的能力，被世界各地广泛运用于治疗各种原因所致的骨缺损及严重的肢体畸形。然而，其最主要的限制在于牵张间隙内的新骨形成缓慢，甚至出现骨痂延迟矿化或不矿化的现象，导致患者需要长时间的佩戴外固定支架直至新骨完全矿化重塑。在此期间，外固定相关并发症随之增加，同时也为患者的生产生活带来了诸多不便。探求不同的方法以促进牵张间隙内的骨组织再生显得尤为重要。因此，本研究拟首先建立一种合理可重复的大鼠股骨牵张成骨模型，并在此基础上探究循环应力刺激（“手风琴”技术）的不同速率、幅度和节律对新骨再生的影响及其可能的分子机制，然后明确低氧促进牵张成骨过程中新骨再生的最佳诱导时机，最后验证循环应力刺激联合局部低氧诱导在牵张成骨过程中的协同促成骨效应。方法：（1）研究的第一部分，选用12只3月龄大小的Sprague-Dawley（SD）成年雄性大鼠，体重约400-420g，并以自行研制的微型轨道式可延长单边外固定支架对大鼠右股骨中段进行截骨。经过5天的潜伏期后，以0.5mm/d的速度开始延长，每天两次，共持续10天，最终延长5mm；随后矿化6周，以建立牵张成骨模型。同时运用X线、苏木素-伊红染色和番红-固绿染色评估牵张区的新骨再生情况。（2）研究的第二部分，选用75只SD成年雄性大鼠，建立牵张成骨模型后，根据干预方法的不同将大鼠随机等分为5组：对照组，普通“手风琴”组，大幅度“手风琴”组，低速率“手风琴”组和同日往复“手风琴”组。分别从影像学、生物力学、组织学及分子生物学等方面评估“手风琴”技术的不同速率、幅度和节律对新骨再生的影响及其可能的分子机制。（3）研究的第三部分，首先通过体外细胞实验验证低氧环境对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。然后选用63只SD成年雄性大鼠建立牵张成骨模型，并随机等分为3组：对照组，牵张期低氧诱导组和矿化期低氧诱导组。分别从影像学、生物力学、组织学及分子生物学等方面评估低氧诱导时机对新骨再生的影响。（4）研究的第四部分，选用84只SD成年雄性大鼠建立牵张成骨模型，并随机等分为4组：对照组，“手风琴”干预组，低氧诱导组和“手风琴”联合低氧诱导组。仍根据影像学、生物力学、组织学及分子生物学等方面评估循环应力刺激联合局部低氧诱导在牵张成骨过程中的协同促成骨效应。结果：（1）第一部分研究的所有大鼠麻醉清醒后均正常存活至取材，饮食、排便正常，单笼饲养时日常活动均无明显受限。各时间节点的标本大体外观评估、影像学检查及组织学检查均符合牵张成骨过程中新骨再生的组织变化特点。（2）第二部分研究结果显示，“手风琴”技术干预后，各实验组的低氧诱导因子1α（hypoxia-induciblefactor1α,HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达上调。所有实验组的新骨再生程度、生物力学性能、成骨和成血管相关蛋白因子表达均优于对照组，且大幅度“手风琴”组和低速率“手风琴”组优于普通“手风琴”组，但同日往复“手风琴”组低于普通“手风琴”组。（3）第三部分研究结果显示，体外低氧环境诱导可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化及钙盐沉积。所有实验组的新骨再生程度、生物力学性能、成骨和成血管相关蛋白因子表达均优于对照组，且牵张期低氧诱导组优于矿化期低氧诱导组。（4）第四部分研究结果显示，所有实验组的新骨再生程度、生物力学性能、成骨和成血管相关蛋白因子表达均优于对照组，且“手风琴”联合低氧诱导组分别优于“手风琴”干预组和低氧诱导组。结论：（1）本研究成功建立了一个合理可重复的大鼠股骨牵张成骨模型，为进一步深入探索促进牵张成骨新骨再生的方法及相关分子生物学机制奠定了坚实的动物模型基础。（2）循环应力刺激可促进牵张成骨过程中的骨组织形成并加快矿化进程；其分子机制可能是机械刺激可诱导牵张区新生组织的局部低氧，从而激发了HIF通路并上调HIF-1α和VEGF的表达，进而增强血管生成和骨形成的偶联作用，最终导致血管生成增多、骨形成加快。此外，适度的增加“手风琴”技术的“压缩-牵张”幅度并降低速率具有更显著的促成骨作用，但不宜采用“压缩和牵张在同一天完成”的节律。（3）体外低氧环境可促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化及钙盐沉积。牵张区的局部低氧诱导可加快骨组织再生及矿化进程，且在牵张期进行低氧诱导的促成骨效果更为显著。（4）联合运用循环应力和局部低氧诱导刺激的促成骨效果较单一干预方式更为显著。
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