摘要
目的：内脏高敏感性（visceral hypersensitivity，VH）是功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）的主要病理生理学基础之一。肠嗜铬细胞（enterochromaffin cell，EC）是肠黏膜上皮中的一种重要的神经内分泌细胞，是胃肠的机械和化学感觉器，合成和分泌的5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）在调节胃肠的运动、分泌，尤其是内脏感觉中发挥重要作用。PIEZO2是一种机械敏感离子通道，近年来被发现在EC中表达，能感应机械刺激促进EC分泌5-HT，参与内脏敏感性（visceral sensitivity，VS）的调控，而作为细胞内第二信使--环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的下游效应蛋白家族之一cAMP直接激活的交换蛋白1（exchange protein1directly activated by cAMP，EPAC1）能选择性地增强PIEZO2介导的机械转导。本研究以FD大鼠为研究对象，以5-HT参与调节胃肠敏感性为切入点，探究电针“足三里”穴治疗FD的效应和作用机制，初步阐明电针通过抑制EPAC1/PIEZO2轴减少胃底EC数量和5-HT分泌，改善VH，从而治疗FD的作用机制，为电针治疗FD提供理论基础。 方法：7日龄SPF级雄性SD乳鼠50只，适应性喂养3天后，随机分为正常组、模型组、电针组、EPAC1抑制剂组和电针+EPAC1抑制剂组，每组各10只。除正常组幼鼠给予0.2ml2%蔗糖溶液灌胃外，余四组幼鼠均采用0.2ml0.1%碘乙酰胺（iodoacetamide，IA）与2%蔗糖混合液灌胃联合成年后夹尾刺激和不规则饮食的复合因素建立FD大鼠模型。电针组选取大鼠双侧后肢“足三里”穴，针刺后连通韩氏穴位神经刺激仪，选择疏密波，频率2/100Hz，电流强度1mA，每次治疗30min，每日1次，连续治疗10天。EPAC1抑制剂组大鼠采用ESI-09（10mg/kg）腹腔注射，每日1次，连续注射10天。电针+EPAC1抑制剂组大鼠采用腹腔注射ESI-09，剂量及干预疗程同EPAC1抑制剂组，抑制剂注射完成30min后，给予电针干预，方法及疗程同电针组。在干预期间，正常组、模型组、抑制剂组大鼠同电针组一样进行束缚固定操作，且正常组、模型组和电针组大鼠腹腔注射0.9%NaCL作为对照，以保证各组实验条件一致性。干预前后，观察各组大鼠一般情况并进行评分，测量体质量、3h进食量，足底机械痛阈值（mechanical pain threshold，MPT），观察腹部回撤反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）并进行评分，进行旷场实验（open field test，OFT）、强迫游泳实验（forced swimming test，FST）。干预结束后各组大鼠禁食不禁水24h，给予2%戊巴比妥钠（5mg/100g）腹腔注射，依次麻醉大鼠后进行取材。根据检测要求采集和保存各组大鼠血清、胃底和脊髓背角组织。采用苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察胃底组织形态与结构情况；采用免疫组织化学技术（immunohistochemical，IHC）观察各组大鼠胃底EC数量；采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测各组大鼠血清、胃底和脊髓背角5-HT水平；采用蛋白免疫印迹法（western blot，WB）检测各组大鼠胃底组织EPAC1、PIEZO2、5-HT3R和脊髓背角c-fos蛋白表达水平；采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测各组大鼠胃底EPAC1、PIEZO2、5-HT3R和脊髓背角c-fos基因表达水平；采用免疫荧光双标法检测各组大鼠胃底5-HT/EPAC1、5-HT/PIEZO2共定位表达情况。 结果：1.电针可改善FD大鼠一般情况、增加体质量和3h进食量，降低VS，改善抑郁情绪。 1.1一般情况及评分 （1）一般情况 造模后大鼠毛发失去光泽、凌乱且稀疏；精神萎靡，扎堆蜷缩，活动降低，体质量显著减轻，进食量显著减少，大便稀溏且色黄绿酸臭难闻；干预后，正常组大鼠毛发、精神活动度、进食量、体质量和粪便情况正常如前；模型组大鼠精神状态稍好转，毛发色泽仍枯黄无光泽，进食量和体质量基本无变化，粪便也常有稀溏伴酸臭味；抑制剂组、电针组和电针+抑制剂组大鼠精神状态好转，毛发恢复光泽、活动动度和灵敏度都大幅提升，食欲逐渐好转，进食量提高，体重虽与正常组还有较大差距，但体重增长速度向正常组靠近，粪便多数成形无味道，偶有稀软酸臭。 （2）一般情况评分 干预前，与正常组比，余四组大鼠一般情况评分均显著降低（均P＜0.01），差异具有显著统计学意义，且四组间比较无差异（P＞0.05）；干预后，与正常组比，模型组评分仍然显著偏低（P＜0.01），有显著统计学差异，电针组、抑制剂组和电抑组三组间评分比较无差异（P＞0.05），均与正常组水平相当（均P＞0.05），且均显著高于模型组（均P＜0.01），差异有显著统计学意义。 1.2体质量 灌胃前，五组大鼠体质量比较无差异（P＞0.05）；夹尾前和干预前，与正常组比，余四组大鼠体质量均显著降低（均P＜0.01），差异具有显著统计学意义，且四组间体质量比较无差异（P＞0.05）；干预后，与正常组比，余四组大鼠体质量均显著偏低（均P＜0.01），差异具有显著统计学意义，电针组、抑制剂组和电抑组大鼠体质量均高于模型组（分别P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01），差异有统计学意义，电针组与抑制剂组大鼠体质量比较无差异（P＞0.05），且电抑组大鼠体质量均高于电针组和抑制剂组（均P＜0.05），有统计学差异。 1.33h进食量 干预前，与正常组比，余四组大鼠3h进食量均显著降低（均P＜0.01），差异具有显著统计学意义，且四组间比较无差异（P＞0.05）；干预后，与正常组比，余四组大鼠3h进食量均显著偏低（均P＜0.01），差异具有显著统计学意义，电针组、抑制剂组和电抑组大鼠3h进食量均显著高于模型组（均P＜0.01），有显著统计学差异，电针组与抑制剂组大鼠3h进食量比较无差异（P＞0.05），且电抑组大鼠3h进食量均高于电针组和抑制剂组（分别P＜0.05、P＜0.01），差异有统计学意义。 1.4内脏敏感性 （1）足底机械痛阈值（MPT） 干预前，与正常组比，余四组大鼠MPT均显著降低（均P＜0.01），差异具有显著统计学意义，且四组间比较无差异（P＞0.05）；干预后，与正常组比，模型组、电针组和抑制剂组大鼠MPT均显著偏低（均P＜0.01），差异具有显著统计学意义，而电抑组大鼠MPT与正常组相当（P＞0.05），电针组、抑制剂组和电抑组大鼠足底MPT均高于模型组（分别P＜0.01、P＜0.05、P＜0.01），有统计学差异，电针组大鼠MPT高于抑制剂组（P＜0.05），差异有统计学意义，且电抑组大鼠MPT均高于电针组和抑制剂组（分别P＜0.05、P＜0.01），差异有统计学意义。 （2）腹部回撤反射（AWR）评分 1.5抑郁情绪 （1）旷场实验（OFT） （2）强迫游泳实验（FST） 1.6胃底组织形态学（HE染色） 2.电针可减少FD大鼠胃底EC数量，降低血清、胃底、脊髓背角5-HT水平 2.1EC数量 2.25-HT水平 3.电针可降低FD大鼠胃底5-HT3R、脊髓背角c-fos蛋白和基因表达水平 （1）胃底组织5-HT3R蛋白水平 （2）脊髓背角c-fos蛋白表达水平 （3）胃底组织5-HT3R基因表达水平 （4）脊髓背角c-fos基因表达水平 4.电针可降低FD大鼠胃底组织EPAC1、PIEZO2蛋白和基因表达水平，减少胃底组织5-HT/EPAC1、5-HT/PIEZO2共表达 4.1胃底组织EPAC1蛋白表达水平 4.2胃底组织PIEZO2蛋白表达水平 4.3胃底组织EPAC1基因表达水平 4.4胃底组织PIEZO2基因表达水平 4.5胃底组织5-HT/EPAC1共表达情况 4.6胃底组织5-HT/PIEZO2共表达情况 结论：1.FD大鼠一般情况变差，体质量下降，3h进食量减少，内脏敏感性增高，并产生抑郁情绪。 2.电针“足三里”穴可改善FD大鼠一般情况，增加体质量和3h进食量，降低内脏敏感性，改善抑郁情绪。 3.电针“足三里”穴可减少FD大鼠胃底EC数量，降低血清、胃底和脊髓背角5-HT水平，下调胃底组织EPAC1、PIEZO2、5-HT3R和脊髓背角c-fos蛋白和基因表达水平，减少胃底组织5-HT/EPAC1、5-HT/PIEZO2共表达，EPAC1抑制剂ESI-09与电针联合运用具有协同作用。 4.电针“足三里”穴可通过抑制EPAC1/PIEZO2轴减少胃底EC数量及5-HT分泌，进而改善FD大鼠内脏敏感性，这是电针治疗FD的可能作用机制。
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