摘要
迄今为止，在所有已有研究的硬骨鱼类中均发现存在免疫球蛋白IgD，但对其表达及功能的研究还很有限。IgD通常以嵌合体形式存在，由一个编码Cμ1结构域和多个Cδ结构域的基因组成，包含分泌型sIgD和膜结合型mIgD，参与硬骨鱼类系统免疫及粘膜免疫防御。 本实验以我国重要的经济养殖鱼类鲤鱼（Cyprinuscarpio）为材料，克隆获得了鲤鱼IgD基因恒定区序列，通过定量PCR及原位杂交方法对TI和TD抗原刺激下的IgD的基因表达及定位进行了检测，同时对比分析了鲤鱼各类已知免疫球蛋白类型在粘膜相关免疫组织以及系统免疫组织中的表达。主要内容包括： 首先，克隆获得的鲤鱼IgD基因序列共1731bp，编码432个氨基酸，包含4个免疫球蛋白样区，多序列比对及进化树构建结果表明，该序列与多种鱼类IgD具有更高的同源性，属于IgD分子。 第二，通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了鲤鱼早期不同发育时期IgD基因的表达，并检测了1年龄鲤鱼不同免疫相关器官中IgD的表达。结果显示，在受精后的第1、2、3、4、6、10、16、24和31天均可检测到IgD的表达，其中，受精后1d的IgD表达量最高，之后的表达水平均低于受精后第一天，但表达量随受精后时间推进逐渐升高，至31d达到较高表达。这一结果提示，鲤鱼受精卵及早期发育过程中可能存在母源性IgD。在1年龄鲤鱼中，IgD在头肾、脾脏、前肠、中肠、后肠、皮肤、鳃、肝脏、脑、肌肉、性腺、口腔上皮12种器官中均检测到不同程度的表达，这一结果也提示IgD可能既参与系统免疫也参与粘膜相关组织的免疫应答。 第三，为进一步研究IgD在鲤鱼系统免疫相关组织及粘膜免疫相关组织中的免疫功能，本研究构建了非胸腺依赖性抗原（TI抗原）和胸腺依赖性抗原（TD抗原）免疫刺激模型。腹腔注射TNP-LPS和TNP-KLH后，检测了免疫刺激后1、3、7、15d鲤鱼头肾、肝脏、皮肤、后肠以及鳃组织中已知免疫球蛋白基因，包括IgD、IgM以及IgZ的三种亚型IgZ1、IgZ2和IgZ3的表达。结果显示：（1）不同免疫球蛋白基因在非胸腺依赖性抗原和胸腺依 赖性抗原刺激下，表现出不同的免疫应答模式。（2）不同免疫球蛋白分子具有特定的组织表达特异性，在鳃组织中，IgD具有更显著的表达倍增。IgZ作为具有粘膜专一性抗体功能的分子，在后肠组织中具有较高的表达。（3）IgD在肝脏组织中也表现出较强的免疫应答，尤其是在TI抗原激活的条件下。 第四，肝脏是联系系统免疫和粘膜免疫的重要位点，也是产生抗体免疫应答的重要器官。后肠和鳃是重要的粘膜免疫组织。在具有较强IgD免疫应答的组织中，IgD的表达升高一方面可能来源于其功能性抗体的增加，另一方面也可能来源于表达IgD分子的B细胞的增殖。因此，对肝脏及粘膜免疫组织中IgD+细胞的检测有助于从细胞水平研究IgD+细胞的组织分布及应答变化。本实验通过原位杂交，对鲤鱼IgD的组织分布进行检测，并以IgZ3+细胞作为对照。结果显示在后肠、鳃、肝脏中均检测到了IgD+细胞，且在TNP-LPS免疫刺激7天后，在肝脏组织中显示出了IgD阳性信号的增强，在鳃组织中出现更为显著的IgD+细胞表达上调，说明鳃可能是IgD的主要功能位点之一。 对IgD在硬骨鱼粘膜组织中免疫应答的研究有助于更深入的认识脊椎动物抗体功能的进化，并为养殖过程中免疫预防策略的选择提供理论依据。
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