摘要
CD5是一种I型跨膜糖蛋白，属于富含半胱氨酸的清道夫受体家族。在B淋巴细胞中，CD5分子不仅可以作为Bla淋巴细胞功能亚群的标志分子，同时，对BCR受体介导的信号活化具有重要的负调控作用。细胞表面标志性分子的缺乏限制了对硬骨鱼类B淋巴细胞功能亚群及其分化发育机制的深入研究，同时，作为最早产生适应性免疫的脊椎动物，硬骨鱼类IgM+B细胞表现出类似晡乳动物B1细胞的细胞特征。因此，CD5分子在硬骨鱼类淋巴细胞中的免疫应答的研究及其在不同B淋巴细胞亚群中的表达定位将为硬骨鱼类B细胞的分群提供新的标志性分子，同时也将成为硬骨鱼类BCR信号活化及其调控机制研究的重要基础。 本实验以鲤鱼为实验材料，主要从以下五个方面对鲤鱼CD5分子进行了基因表达及功能分析。 _、克隆获得了鲤鱼CD5基因序列984bp，包含完整的ORF区，长度750bp，编码249个氨基酸，具有信号肽、跨膜结构域及保守的SRCR结构域，胞外区存在两个N-连接的糖基化位点，胞内区存在多个PKA、PKC及p38MAPK磷酸化位点。 二、构建鲤鱼CD5胞外区原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)及ROSSETA，诱导表达并纯化CD5蛋白，分别制备获得多克隆抗体及单克隆抗体7株并对抗体进行了筛选检测，确定CD5多克隆抗体及单克隆抗体C8及C9用于后续实验。 三、构建T细胞非依赖性抗原TNP-LPS及T细胞依赖性抗原TNP-KLH腹腔注射免疫刺激鲤鱼模型，分别提取脾脏、外周血及腹腔三种来源的淋巴细胞，对其免疫刺激后的Id、3d、7d和15d的13种基因进行表达检测，包括：B细胞分化相关转录因子blimp1、pax5、irf-5,BCR信号复合物mlgM及CD79a，免疫球蛋白slgM、IgZ3、IgZ2、IgZl及细胞表面分化抗原CD3、CD4、CD8、CD5。结果表明：①三种组织来源的淋巴细胞在TI和TD免疫应答中具有显著的表达差异，表明了三种组织来源的淋巴细胞在细胞组成及功能上具有明显差异；②CD5在脾脏来源的淋巴细胞和腹腔来源的淋巴细胞中的表达均高于外周血来源的淋巴细胞；仅在脾脏淋巴细胞中，针对TI抗原刺激CD5出现显著的表达升高，而在TD抗原刺激下，脾脏淋巴细胞在刺激后的1d、7d,腹腔淋巴细胞在刺激后的3d和15d出现显著的表达升高。③在三种来源的淋巴细胞中，mlgM及CD79a分子的表达均表现出显著的正相关，说明在上述免疫刺激条件下，BCR信号复合体的活化参与免疫应答过程。而作为B淋巴细胞成熟分化的重要标志性分子，Pax5与Blimp-1具有显著的负相关性，这与其分别在B细胞特定分化阶段表达的特征相一致。并且，Pax5与CD79a、mlgM表达也具有了正相关，说明在以Pax5为标志的成熟B细胞阶段，存在抗原依赖的B细胞活化，以CD79a、mlgM的表达为特征，而在以Blimp-1为标志的浆细胞阶段，CD79a、mlgM的表达会降低。 四、淋巴细胞体外刺激实验检测LPS和BCR交联信号刺激下，外周血淋巴细胞及腹腔淋巴细胞的信号通路活化。对BCR信号通路相关的10种分子的抗体进行了筛选和检测，包括Syk、p-Syk、ZAP-70、p-ZAP-70、p-BLNK、SHP1(3244)、SHP1(2406)、p-Akt、MAPK、p-MAPK。结果表明：①IgM抗体处理激活BCR信号使外周血淋巴细胞中p-BLNK活化，而抑制性分子SHP1则表达升高。②腹腔淋巴细胞中，IgM抗体处理对MAPK信号通路产生抑制作用。上述结果表明：在外周血淋巴细胞中，BCR信号复合体的活化能够活化下游分子BLNK，而SHP1是CD5抑制BCR信号的关键分子，其表达升高为进一步分析外周血淋巴细胞中BCR信号的抑制性调控及其上游信号的确定提供了基础数据。MAPK信号通路也参与鲤鱼淋巴细胞BCR信号活化及其信号转导过程。 五、利用CD5抗体与IgM抗体，对外周血和腹腔来源的淋巴细胞进行免疫荧标记，结果表明，CD5与IgM共定位于部分淋巴细胞中，两种组织来源的淋巴细胞中均存在IgM+CD5+细胞、IgM+CD5_细胞、IgMCD5+细胞、IgMCD5_细胞。使用LPS处理外周血淋巴细胞和腹腔淋巴细胞并进行流式检测，结果表明：LPS刺激使外周血中IgM+CD5+细胞由6.7%降低到3.0%，而IgM+CD5细胞由5.1%升高到10.6%;LPS刺激使腹腔淋巴细胞中IgM+CD5细胞由8.6%升高到11.2%，而IgM+CD5+细胞比例无明显变化。在晡乳动物中LPS可以在体外激活B1细胞亚群的增殖及抗体分泌，上述实验表明，对于鲤鱼IgM+B淋巴细胞中，不表达CD5分子的IgM+B细胞和表达CD5分子的IgM+B细胞对LPS刺激具有显著的差异，此结果为进一步研究两个细胞亚群的细胞增殖活性及功能差异提供了重要基础。 综上所述，本实验对鲤鱼CD5基因及其在淋巴细胞免疫应答中的初步研究，筛选获得了CD5的单克隆抗体及多克隆抗体，为鲤鱼淋巴细胞亚群的分析及功能研究提供了重要的技术工具。明确分析了鲤鱼不同组织来源淋巴细胞在TI、TD抗原刺激中的免疫应答差异，初步检测了淋巴细胞中BLNK及MAPK信号通路在BCR信号复合体介导的信号通路中的作用，通过CD5抗体及IgM抗体免疫荧光标记，明确划分了鲤鱼淋巴细胞中IgM+CD5+细胞、IgM+CD5细胞等细胞亚群，检测了LPS体外刺激对不同细胞亚群的影响。本实验为进一步深入研究鲤鱼B淋巴细胞分化及免疫功能奠定了基础，有助于进一步阐明鲤鱼抗体产生的分子机制，为养殖过程中免疫预防策略的选择提供理论依据。
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