摘要
氧是机体新陈代谢和维持生存的重要因素之一。脑是对氧需求最高的器官，在某些生理或病理性的低氧条件下，细胞可通过低氧感知信号通路和能量代谢转变来维持细胞功能。低氧诱导因子-1（Hypoxia-induciblefactor-1,HIF-1)是细胞感知低氧的关键因子，可启动一系列下游基因的表达以适应氧浓度的变化。HIF-1靶基因参与细胞代谢、生存与增殖、细胞凋亡和神经发育等生物学过程。低氧是一把双刃剑，长期严重缺氧能对机体造成损伤，而温和短暂的低氧却具有促健康效应。低氧预适应或低氧训练是国内外公认的减轻缺氧损伤的干预措施。近年来，越来越多研究显示低氧对脑缺血、神经退行性疾病及精神疾病都有预防和治疗作用。 另一方面，低氧还可以诱导细胞内能量代谢的转变来适应环境的变化。在低氧条件下，细胞内的能量代谢模式转变为糖酵解，糖代谢的终产物为乳酸。乳酸不仅可以作为能量底物为神经元供能，同时，还可以作为信号分子，激活一系列信号通路，促进突触可塑性，增强学习记忆能力。并且，乳酸还能够预防糖氧剥夺诱导的海马神经元死亡。因此乳酸在能量代谢、突触可塑、记忆形成和减轻神经元损伤等一系列神经活动中发挥着重要作用。 为了揭示低氧预适应的神经保护作用，探讨低氧诱导产生的乳酸在其中所扮演的角色，本研究选择HT22细胞、PC12细胞缺氧损伤的体外模型，重点观察了低氧预适应对HT22细胞活性、线粒体代谢、能量代谢通路以及相关蛋白表达等方面的影响，采用小分子抑制剂或RNA干扰等技术探讨了乳酸在其中所扮演的角色。最后，我们还利用乳酸合成抑制剂，对阻断乳酸合成加重HT22细胞缺氧损伤进行了初步研究。 结果： 1、在HT22、PC12细胞中，不同低氧条件（10%O2、3%O2、1%O2）均能够提高细胞外乳酸水平，增强细胞活性。添加外源性乳酸（2.5-10mM）也能够增强细胞活性。采用小分子抑制剂草氨酸钠阻断乳酸合成或乳酸合成酶LDHA特异性敲低均能够抑制低氧对细胞活性的增强作用。 2、缺氧（0.3%O2）或氧糖剥夺（Oxygen-glucosedeprivation，OGD）能够显著降低HT22、PC12细胞活性，低氧预适应HT22、PC12细胞12h减轻缺氧或氧糖剥夺损伤。 3、为进一步探讨其作用机制，在后续的实验中，我们选择3%O2预适应12h、随后进行0.3%O2的缺氧损伤24h作为实验条件。细胞周期检测结果显示，3%O2低氧预适应则能够减缓缺氧损伤后细胞周期阻滞。 4、对线粒体功能检测表明，3%O2低氧预适应则逆转了线粒体功能，表现为MMP水平上升，细胞内ATP生成增加。对糖酵解代谢检测表明，缺氧损伤引起细胞外酸化率升高，而低氧预适应则抑制细胞外酸化率的升高。 5、蛋白印迹结果表明低氧预适应能够减轻缺氧对PSD95、p-CREB、Homer1、BDNF蛋白的下调作用。实时定量PCR结果显示低氧预适应能够减轻缺氧对PSD95、Homer1、BDNF基因的下调作用。 结论： 1、不同低氧条件均能够增强细胞活性，提高乳酸水平，进一步实验证实乳酸在低氧下提高细胞活性中起着重要作用。同时，低氧预适应能够减轻缺氧或氧糖剥夺对HT22细胞的损伤效应。 2、低氧预适应能够逆转缺氧对细胞周期的阻滞效应，减轻缺氧损伤所引起线粒体功能障碍，降低糖酵解，维持细胞生存。同时低氧预适应恢复学习记忆相关蛋白的下调作用。 第二部分：阻断乳酸合成加重HT22细胞缺氧性损伤的机制 结果： 1、不同浓度(2.5、5mM)的2-DG处理HT22细胞，乳酸含量显著降低，HT22细胞活性降低；缺氧处理能够显著升高乳酸浓度，降低细胞活性，但2-DG可抑制其诱导效应，细胞活性下降更为显著。 2、5mM的2-DG和缺氧单独处理均能够升高细胞内活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）水平，下调超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)和过氧化氢酶(Catalase，CAT)的酶活性，2-DG和缺氧联合处理使细胞内ROS水平升高更为显著，这两种抗氧化酶活力下降更为明显。 3、单独的2-DG组和缺氧组能提升p-p38、p-AMPK蛋白的表达水平，2-DG和缺氧联合处理组p-p38、p-AMPK蛋白的表达水平显著上调。 结论： 1、缺氧下阻断乳酸合成的细胞损伤机制与细胞内ROS的增加，SOD、CAT活性的降低，导致氧化应激损伤。 2、缺氧下阻断乳酸合成通过上调p-p38、p-AMPK蛋白的表达，进而与诱发HT22细胞的生存相关信号通路有关。
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