摘要
L-天冬酰胺酶是治疗儿童急性淋巴细胞白血病等血液癌症的重要药物，也是去除油炸食品中致癌物质丙烯酰胺的关键酶。由于现有的以动物来源为主的L-天冬酰胺酶存在半衰期短、稳定性差、活性低等问题，因此，急需寻找性质优良的L-天冬酰胺酶的新来源。本实验室前期筛选到一株新颖的中华陶厄氏菌Thauera sinica K11T，经序列对比分析发现，该菌株的基因序列中有可编码L-天冬酰胺酶的基因。因此，本论文将对该微生物来源的L-天冬酰胺酶的重组表达、产酶发酵条件优化、酶学性质分析及定点突变改造等进行研究，为该酶的推广应用奠定基础。 首先，利用基因工程技术成功构建了两株L-天冬酰胺酶的异源表达菌株E.coli BL21-pET28a-ansB1和E.coli BL21-pDE1-ansB2。经过对发酵条件的优化，重组菌E.coli BL21-pET28a-ansB1的最适产酶条件为：麦芽糖为碳源，天冬酰胺为氮源，IPTG终浓度为1.0mM，诱导时间为8h，诱导温度为30℃。重组菌E.coli BL21-pDE1-ansB2的最适产酶条件为：：酵母粉为碳源，氯化铵为氮源，IPTG终浓度为0.5mM，诱导时间为10h，诱导温度为30℃。 其次，对重组菌E.coli BL21-pET28a-ansB1生产的L-天冬酰胺酶的性质进行了表征。结果表明，L-天冬酰胺酶的最适温度和pH分别为55℃和8.0，且该酶在50℃-70℃和pH6.0-8.0条件下较为稳定；Mg2+、Mn2+、Ba2+、Ni2+对酶活有一定的促进作用，而Ag+、Hg2+和SDS对酶活有强烈的抑制作用，Ca2+、Fe2+、Fe3+、Co2+、Cu2+、Span-80和EDTA对酶活有轻微的抑制作用，Zn2+、Na+、K+、Cr3+、Triton X-100对酶活性几乎无影响；L-天冬酰胺为底物时，该酶的动力学参数Km值为2.683mM，V max值为83.33μmol·min-1·mg-1。 最后，在重组菌E.coli BL21-pET28a-ansB1的基础上，利用重折叠PCR技术制备了带有突变位点的目的基因，构建了三种突变重组菌，并对突变体G129AASN、P130AASN和S252NASN的酶学性质进行了研究。G129AASN的酶学性质：最适反应条件为55℃、pH8.0；该酶在pH6.0-10.0、温度小于60℃时稳定性较好；Co2+对该酶的活性具有一定的促进作用；该酶对四种酰胺类底物的活性均有所增加；该酶的Km和Vmax分别为2.097mM和81.3μmol·min-1·mg-1。P130AASN的酶学性质：最适反应条件为55℃、pH7.0；该酶在pH6.0-11.0、温度小于70℃时稳定性较好；Co2+对该酶的活性具有一定的促进作用，Mg2+、Ba2+在一定程度上抑制酶的活性；该酶对D-谷氨酰胺的活性降低，对其余酰胺类底物活性均增加；该酶的Km和Vmax分别为2.69mM和64.52μmol·min-1·mg-1。S252NASN的酶学性质：最适反应条件为55℃、pH8.0；该酶在温度低于75℃、pH6.0-10.0时，稳定性较好；Co2+、Cr3+对该酶的活性具有一定的促进作用，Mn2+、Ba2+在一定程度上抑制酶的活性；该酶对天冬酰胺类底物的活性轻微降低，对谷氨酰胺类的活性增加；该酶的Km和Vmax分别为3.899mM和91.74μmol·min-1·mg-1。
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