摘要
荧光探针是一类高附加值的精细化学品，可作为试剂盒用于生命科学研究和临床医学诊断，具有产量小、产值高等特点。利用荧光探针研究细胞、组织及活体内待测物浓度变化的方法已广泛应用于免疫分析、疾病诊断、药物筛选、手术导航等方面，具有响应速度快、灵敏度高、安全性高等特点。 过氧亚硝酸根（ONOO?）是由一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O2??）结合生成的产物，在生理条件下具有活性高、半衰期短的特点。研究表明，过氧亚硝酸根具有强氧化性和细胞毒性，能与机体内的蛋白质、脂质、核酸等多种生物组分发生反应，影响细胞信号传导和功能，进而介导多种疾病的发生。利用高灵敏度和高选择性的小分子荧光探针研究ONOO?在体内不同疾病模型中的产生及分布，对于阐明相关疾病的致病机制具有重要意义。因此，设计合成响应ONOO?的小分子荧光探针，不仅能够推动ONOO?相关疾病的分子机制研究，而且具有广阔的市场应用前景。 为此，本文以萘酰亚胺为荧光母体，发展了两种新型的分子荧光探针，能够对ONOO?产生特异性荧光响应，并分别应用于阿尔茨海默病和铁死亡的分子机制研究之中。 （1）脑内ONOO?水平与阿尔茨海默病的发病机制存在密切关联。然而，受光穿透深度和血脑屏障穿透性的限制，现有的荧光探针难以对活体动物脑内ONOO?进行原位成像检测，这严重阻碍了人们对阿尔茨海默病发病机制的深入理解和新型药物的研发。我们选择课题组前期设计合成的基于萘酰亚胺荧光团的双光子荧光探针NATP，用于研究阿尔茨海默病模型中ONOO?的水平变化。借助该探针，观察到β-淀粉样蛋白在神经细胞中诱导产生大量ONOO?，该过程同时伴随着谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达下调，表明神经细胞发生了铁死亡。此外，成功建立了一种基于荧光的高通量筛选平台，从具备抗氧化潜力的天然产物中筛选获取有效的神经保护剂，用来抑制β-淀粉样蛋白诱导的神经细胞氧化应激。更重要的是，该探针具有双光子成像能力和血脑屏障穿透能力，能够对活体小鼠脑内的ONOO?进行原位荧光成像。脑部成像结果表明，阿尔茨海默病小鼠脑内ONOO?水平显著高于健康小鼠。本项研究提供了一种双光子荧光探针，可以用于原位成像小鼠脑内ONOO?的水平变化，为研究阿尔茨海默病病理进程中ONOO?相关的致病机制提供了新型成像工具。 （2）铁死亡是一种新型的程序性细胞死亡模式，是多种疾病发病机制的基础。研究人员对铁死亡的分子机制进行了广泛研究，但是对于线粒体活性氧（ROS）与铁死亡之间的功能相关性仍然存在疑问，部分原因在于人们对于铁死亡过程中线粒体内ROS的水平变化尚不明确。传统的线粒体靶向探针在进入线粒体前可能与细胞质中的ROS发生反应并表现出荧光变化，从而导致对线粒体内ROS的水平变化产生错误判断，进而对其生物功能产生误判。ONOO?是ROS家族的重要成员，具有较高的细胞毒性，是细胞铁死亡的重要执行者。为了解决上述问题，我们合理设计了一种光激活型线粒体靶向荧光探针PMFP，借助该探针，成功实现了铁死亡过程中线粒体内ONOO?的原位可视化。光激活探针PMFP对ONOO?具有高度特异性和敏感的荧光响应，且能够通过紫外光或双光子激光照射调节反应活性。这种光控荧光成像策略能够保证所有的探针分子都以惰性状态通过细胞质，到达线粒体后才被光激活，从而消除线粒体外ONOO?的干扰，因此能够提高活细胞和动物模型中线粒体ONOO?生物成像的保真度。利用该探针，我们揭示了erastin诱导的铁死亡过程中线粒体内ONOO?的过量产生及其主要生物来源。上述实验结果表明，线粒体ONOO?及ROS与铁死亡进程密切相关，该发现将进一步促进研究人员对铁死亡机制的全面探索和过程的分子调控。 综上所述，本论文发展了两种新型的分子荧光探针，均对ONOO?具有较高的灵敏度和选择性，且响应迅速，能够对细胞及活体组织中的ONOO?浓度变化进行原位成像监测，并分别应用于阿尔茨海默病和铁死亡的分子机制研究之中。本论文研发的荧光探针可进一步开发成试剂盒用于生命科学研究之中，具有重要的应用价值和广阔的市场前景。
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