摘要
肿瘤标志物是由肿瘤细胞异常或宿主响应肿瘤的刺激反应产生的一类活性物质（包括核酸、蛋白质和小分子等）。这类物质在正常细胞内的表达水平极低甚至不存在，主要存在于患者的组织、细胞、血清、体液及排泄物中。目前，肿瘤标志物已经作为一种新型工具代替传统的依赖症状和形态的做法来诊断早期肿瘤。这种转变一方面能够及早诊断病情，风险分层，改善预后，提高患者的生存质量。另一方面，对这类物质的结构和功能的研究可能为恶性转化、肿瘤侵袭、转移和新的治疗选择的发展提供进一步的见解。因此，灵敏、准确地检测肿瘤标志物对于癌症的早期诊断和预后具有重要意义。基于此，研究者构建了一系列基于纯核酸结构或微/纳米材料与核酸结构结合的传感策略用于相关肿瘤标志物的检测。虽然这些策略在一定程度上取得了较满意的检测结果，但是随着研究的深入和检测需求的提升，仍然存在一些不足和挑战:1)现有的基于三维(3-D)DNAwalker的荧光传感策略，行走链与轨道链通过单一强度的亲和力结合，行走过程中容易出现脱轨或停滞，影响walker的持续运行能力和信号放大能力;2）现有的基于DNAwalker的荧光传感策略通过消耗有限的轨道链来输出信号，不足以用于痕量生物分子的检测;3）如何通过降低干扰组分影响实现复杂体系中生物分子的灵敏检测;4）如何构建活细胞内基于单一集成探针的响应策略，避免多个探针带来的非特异性干扰？ 本论文基于上述的不足和挑战，开发了一些新型的荧光生物传感策略，并将其应用于疾病相关microRNA、凝血酶、溶液和细胞内皮瓣内切酶1(FEN1)的检测。论文包括以下六个章节: 第一章为绪论部分，主要总结了本工作涉及的相关肿瘤标志物的生物学功能、检测意义，基于纯核酸结构和基于微/纳米材料和核酸结构结合的荧光生物传感策略的设计原理及应用，以及目前仍有待解决的科学问题和本论文的研究内容。 第二章，构建了一种基于双足不等价的3-DDNAwalker荧光生物传感策略，用于溶液中microRNA的灵敏检测。该DNAwalker包括三个组成部分:i）DNA三向节开关(DTWJS)，其中包含不同序列的两条较长的链部分互补，作为双足不等价行走链(B-UWS)，较短的链作为封闭链;ii）荧光团标记的发夹H1和H2，共同修饰到金纳米颗粒(AuNPs)上，用作轨道链;iii)发夹H3和H4，分别包含与H1和H2互补的序列，用作燃料链。当目标microRNA存在时，microRNA与封闭链杂交，释放B-UWS。然后，B-UWS沿着三维轨道运行，并依次触发两组(H1/H3、H2/H4)催化发夹自组装(CHA)反应，产生大量的荧光信号。本设计中，B-UWS包含一个较长的和一个较短的行走序列，两者与轨道链的结合亲和力存在差异。这种差异带来的B-UWS和轨道链之间的杂交稳定性不同，减少了B-UWS同时脱轨或停滞的概率。通过考察动力学和亲和力发现，这种walker的可持续操作能力是单足和双足等价DNAwalker的两倍。并且，本DNAwalker传感策略对let-7a显示出68pM的检测限和令人满意的生物流体再现性。实验结果表明，本工作为DNAwalker的可持续运行提供了一种新的模式，为microRNA的灵敏检测提供了一种新的方式。 第三章，构建了一种DNAzymewalker诱导DNAzyme切割反应的级联信号放大策略用于凝血酶的灵敏检测。首先，通过将行走链(Walkingstrand)和轨道链(Trackstrand)共修饰到AuNPs表面构建DNAzymewalker。Walkingstrand是一条含有DNAzyme序列的单链DNA，由凝血酶适体序列预先锁定。Trackstrand是专门设计的发夹DNA，环部嵌入了RNA切割位点，茎部封闭相同的DNAzyme序列。当凝血酶存在时，其特异性地与适体序列结合释放Walkingstrand，暴露出预先锁定的DNAzyme。随后，DNAzyme催化切割Trackstrand以驱动DNAwalker运行，暴露出大量预埋在Trackstrand中的DNAzyme。然后，新暴露出的DNAzyme序列与标记有荧光团和淬灭团并嵌入了DNAzyme裂解位点的Reporterprobe杂交，并催化它们的连续裂解，产生大量的荧光信号。DNAwalker的运行和DNAzyme切割反应的级联放大效应保证了本策略的信号放大效率和检测灵敏度。对于凝血酶的检测，本策略显示了0.02-15nM的宽线性，检测限低至4.5pM，在复杂基质血清样品应用中获得了良好的重现性。实验结果表明，本策略为蛋白质的灵敏分析提供了一种新的方法，将成为疾病诊断和临床研究中一种很有前途的分析工具。 第四章，构建了一种磁分离辅助的级联杂交链式反应(HCR)放大策略，用于FEN1的灵敏检测。首先，在磁珠表面修饰含有FEN1识别位点（5''悬垂DNA皮瓣）的分叉双链DNA，形成磁性识别探针。当FEN1存在时，它可以识别并催化去除5''DNA皮瓣至溶液中，并通过磁分离纯化。然后，获得的皮瓣结构用作触发剂，以激活发夹探针H1和H2的线性组装(初级HCR)，形成带有分裂片段的缺口双螺旋结构。最后，这些分裂的片段作为新的触发剂激活发夹探针H3和H4的分支组装(次级HCR)，使得标记在H3上的荧光团/淬灭团远离，荧光恢复。得益于磁分离对触发链的纯化和级联HCR的信号放大效应，本策略对于FEN1的检测限低至3.6×10-5UμL-1，并能够用于血清和细胞裂解液中FEN1的分析。这些结果表明，本策略为早期肿瘤诊断和预后中FEN1的灵敏检测提供了有效的方法。 第五章，构建了一种可崩解的DNA纳米微凝胶响应策略，用于肿瘤细胞内FEN1的检测和成像。首先，设计两组含有5''悬伸DNA皮瓣结构的叉状双螺旋结构（即模块B1和B2），两对茎部和环部封闭了粘蛋白1适体序列的发夹(即模块H1和H2)。四种模块通过末端的DNA互补杂交，组装形成具有网格结构的DNA纳米微凝胶骨架。当FEN1存在时，其特异性的识别并催化切割5''悬伸的DNA皮瓣结构，使得DNA纳米微凝胶结构崩解，预先靠近的荧光团和淬灭团在空间上远离，收集荧光信号用于细胞内FEN1的灵敏检测和成像。DNA纳米微凝胶集信号识别单元、转导单元和输出单元于一体，避免了多个核酸探针加入带来的非特异性干扰。并且，其自身可以通过胞吞作用进入细胞，无需其他转染试剂。此外，DNA纳米微凝胶由纯核酸结构通过自组装形成，生物相容性好，对细胞本身的生理活动和环境影响较小。因此，基于可崩解的DNA纳米凝胶响应策略，对FEN1的检测限为0.54pM，并能够对正常细胞和肿瘤细胞内FEN1的表达水平进行区分，为细胞内FEN1的检测和成像提供一种新的思路。 第六章为结论部分，主要包括本论文的创新点和前景展望。
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