摘要
研究背景 冠状动脉粥样硬化是冠状动脉硬化性心脏病的重要病理学基础，而内皮功能障碍则是冠状动脉粥样硬化的早期步骤。其中，血管内皮氧化应激损伤是导致内皮功能障碍的重要机制：一方面，氧化应激通过激活转录因子、上调黏附分子、刺激趋化因子和募集炎症细胞等途径诱导血管炎症和损伤；另一方面，氧化应激细胞内ROS水平升高致使线粒体损伤，受损的线粒体释放其内容物，通过激活Caspase级联反应触发细胞凋亡，造成细胞损伤。因此，抑制内皮细胞的氧化应激损伤对于保护内皮功能甚至延缓冠状动脉粥样硬化进程都具有重要的临床意义。 热休克蛋白27（heatshockprotein27，HSP27）是一种可以在各种应激条件下诱导表达的多功能蛋白，能够保护细胞免受应激损伤。近年来研究发现，HSP27不仅能够调控细胞凋亡，还能够通过调节细胞自噬进而影响应激条件下结肠癌或肝癌细胞凋亡，利于细胞的存活。不同程度的细胞自噬对氧化应激条件下的细胞凋亡产生不同的影响。一方面，适度的自噬通过抑制凋亡、焦亡和炎症反应等途径使细胞免受氧化应激损伤；另一方面，过度自噬会促进细胞凋亡，加重氧化应激损伤。因此，探究细胞自噬对氧化应激诱导的细胞凋亡的影响以及HSP27在自噬和凋亡中的作用，对于阐明HSP27对抗血管内皮细胞氧化应激损伤的机制具有重要意义。 在细胞自噬的过程中，ATG7作为ATG家族中的成员之一，编码了自噬系统中唯一的一种E1样酶（泛素激活酶），有助于两个泛素化结合系统中多个自噬相关蛋白的活化，在吞噬体延伸和自噬体形成过程中起着至关重要的作用。此外，研究还发现下调ATG7的表达能够促使腺泡细胞中凋亡水平升高。由此可见，ATG7不仅能够参与细胞自噬，还能够影响细胞凋亡，最终影响细胞存活。因此，干预ATG7介导的细胞自噬可能有助于减轻应激引发的细胞凋亡，对细胞能够在氧化应激状态下的存活具有积极作用。而既往一项调节果蝇眼睛形态的研究发现HSP27和ATG7之间可能存在调控关系。因此，我们推测HSP27可能通过调控ATG7促进细胞自噬抑制细胞凋亡以减轻细胞损伤，发挥抗氧化应激作用。 研究目的 本研究以人冠状动脉内皮细胞HCAECs为研究对象，应用H2O2刺激构建氧化应激损伤模型，探究氧化应激对HCAECs的损伤机制并观察HSP27的变化趋势及其发挥抗氧化应激作用的机制是否与细胞自噬相关，并进一步探索其调控细胞自噬的分子机制。 研究方法 1.H2O2处理HCAECs构建氧化应激损伤模型。CCK-8检测细胞活性，乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒检测LDH活性，DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平，westernblot技术检测细胞凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3、Caspase-3、Bax、Bak以及Bcl-2的表达情况，探究氧化应激对HCAECs的影响。 2.应用westernblot技术检测H2O2刺激下HCAECs中HSP27的表达水平。利用慢病毒转染构建HSP27高、低表达模型，westernblot与实时定量PCR检测转染模型。在高、低表达HSP27细胞中，检测细胞活性及LDH活性，westernblot检测凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3、Caspase-3、Bax、Bak以及Bcl-2的表达情况，TUNEL染色检测凋亡细胞并评估凋亡率，探究HSP27对氧化应激诱导的细胞凋亡的影响。 3.应用westernblot技术检测H2O2刺激下自噬相关蛋白Beclin-1、LC3及P62的表达情况，电镜下观察自噬体的微观形态，利用免疫荧光染色观察LC3的蛋白含量及其在细胞中的分布情况，评估细胞自噬水平。应用westernblot技术检测使用自噬抑制剂3-MA预处理HCAECs后自噬相关蛋白Beclin-1、LC3及P62的表达情况，LC3免疫荧光染色等方法评估细胞自噬水平；检测3-MA预处理HCAECs后的细胞活性及LDH活性，凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3、Caspase-3、Bax、Bak以及Bcl-2的表达情况，TUNEL染色检测细胞凋亡率的变化情况，评估抑制细胞自噬对细胞凋亡的影响。再次检测转染高低表达HSP27细胞中自噬相关蛋白LC3及P62的表达情况，免疫荧光染色标记LC3并观察其聚集情况，探究HSP27对氧化应激诱导的HCAECs细胞自噬的影响。 4.应用westernblot检测ATG7在H2O2刺激下HCAECs中的表达情况以及高表达与低表达HSP27细胞中ATG7的表达情况。利用siRNA转染技术构建ATG7低表达模型并应用实时定量PCR技术检测ATG7的表达情况。在H2O2刺激下，检测下调ATG7表达后的细胞活性与LDH活性，自噬相关蛋白LC3及P62、凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3、Caspase-3、Bax、Bak以及Bcl-2的表达情况。同时，在高表达HSP27细胞中转染siATG7质粒，并再次检测上述指标，探究HSP27的抗氧化应激作用是否通过调控ATG7促进细胞自噬抑制细胞凋亡而实现的。 研究结果 1.氧化应激损伤模型的构建及H2O2对HCAECs的影响：H2O2刺激引起HCAECs的细胞活性呈时间依赖性下降而LDH活性呈时间依赖性升高，细胞内ROS水平明显升高；与此同时，随着H2O2刺激时间的延长，凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3/Caspase-3比值、Bax和Bak水平不断升高，Bcl-2水平不断下降，细胞凋亡水平升高。 2.HSP27对H2O2诱导的HCAECs凋亡的影响：H2O2刺激下，HCAECs中HSP27的蛋白水平呈时间依赖性升高。高表达HSP27提高了H2O2刺激下的细胞活性并降低了LDH活性，CleavedCaspase-3/Caspase-3比值、Bax和Bak的表达水平下降而Bcl-2的表达水平升高，抑制了细胞凋亡；与此相反，低表达HSP27使H2O2刺激下的细胞活性进一步下降而LDH活性进一步升高，CleavedCaspase-3/Caspase-3比值、Bax和Bak的表达水平进一步升高而Bcl-2的表达水平进一步下降，促进了细胞凋亡。 3.HSP27对H2O2诱导的HCAECs自噬的影响：H2O2刺激使自噬相关蛋白Beclin-1水平和LC3-II/LC3-I比值不断升高，P62水平不断下降；在H2O2条件下，免疫荧光染色可见LC3出现明显的点状聚集，电镜下可见自噬体的双层膜结构，提示细胞自噬水平升高。加入自噬抑制剂3-MA预处理后，Beclin-1水平和LC3-II/LC3-I比值下降，P62水平升高，LC3在胞质的点状聚集明显减少，H2O2诱导的细胞自噬被明显抑制。应用3-MA抑制细胞自噬后，H2O2刺激下的细胞活性进一步下降而LDH活性、CleavedCaspase-3/Caspase-3比值、Bax和Bak的表达水平进一步升高，Bcl-2的表达水平进一步下降，加重了细胞损伤。高表达HSP27促使H2O2刺激下LC3-II/LC3-I比值进一步升高，P62水平进一步下降，LC3在胞质的点状聚集增多，促进了细胞自噬；与此相反，低表达HSP27使H2O2刺激下LC3-II/LC3-I的比值下降，P62水平升高，LC3在胞质的点状聚集减少，抑制了细胞自噬。 4.HSP27通过调控ATG7介导的细胞自噬对H2O2诱导的HCAECs凋亡的影响：在H2O2诱导的HCAECs损伤中，ATG7的蛋白水平明显升高，而高表达HSP27能够进一步促进ATG7的表达。在H2O2刺激下，下调ATG7的表达使细胞活性进一步下降而LDH活性进一步升高，LC3-II/LC3-I比值下降而P62蛋白水平升高，CleavedCaspase-3/Caspase-3比值、Bax和Bak的水平进一步升高而Bcl-2的表达水平进一步下降；在高表达HSP27细胞中抑制ATG7的表达，部分抵消了高表达HSP27引起的LC3-II/LC3-I比值的升高和P62水平的下降以及CleavedCaspase-3/Caspase-3比值、Bax、Bak的表达水平的下降和Bcl-2表达水平的升高。 结论 H2O2能够诱导HCAECs凋亡、自噬以及HSP27蛋白表达；抑制细胞自噬使凋亡水平进一步升高，加重HCAECs的氧化应激损伤；而HSP27通过调控ATG7促进细胞自噬抑制细胞凋亡，减轻了氧化应激引起的HCAECs损伤。 创新点及研究意义 早期冠状动脉内皮细胞损伤是冠状动脉粥样硬化的始动环节，因此内皮细胞对抗氧化应激的能力是减轻内皮细胞损伤甚至延缓冠状动脉粥样硬化的关键所在。本研究首先明确了细胞自噬在内皮细胞氧化应激损伤中的细胞保护作用，随后又明确了HSP27通过促进细胞自噬进而影响细胞凋亡来对抗内皮细胞的氧化应激损伤，并进一步揭示HSP27的这种抗氧化应激损伤的机制是通过调控ATG7实现的。本研究为HSP27的抗氧化应激损伤作用提供了新的科学依据，为冠状动脉粥样硬化的早期预防和治疗提供了新的理论基础。
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