摘要
药物先导化合物结构的确定以及药物作用靶标的选择确认是药物研发过程中的关键过程，而高通量药物筛选技术是新药发现中不可或缺的手段。根据已证实靶点蛋白互作形成的复合物空间结构，从庞大的药物库中初步筛选出一系列可匹配的高活性分子结构，是药物开发全产业链的关键环节。由于药物研发后期的合成、优化、临床前及临床试验手段已较为成熟，整个研发环节的技术壁垒仍是先导化合物的发现，因此高通量药物筛选成为其中的重中之重。 实现靶向筛选是高通量药筛领域极为重要的功能，但现有的技术成熟度较低且成本较高，如热门的DNA编码化合物技术平台，无法适用于多种药物种类筛选、使用价格昂贵；而在蛋白互作的水平上进行高通量药物筛选，对于当前的新药开发领域仍十分挑战，SPR、FPA和AlphaScreen等几种主流的筛选方法仍面临着一些无法克服的技术障碍，但迫于对新活性分子发现的巨大需求，这些技术相关的产品和服务仍得到了广泛地应用。 本论文开发了一种高通量靶向药筛技术—High-throughputtargeted-DrugSERScreen（HTTD-SERScreen）。当今高通量药物筛选技术的发展要求如灵敏性强、高效率以及无损检测等特性，而HTTD-SERScreen在这些基础之上，更有着不可比拟的新开发潜力。本论文以热门免疫检查点—PD-1/PD-L1为开发目标，组装了针对性的HTTD-SERScreen平台。首先用紫外分光光度仪、Zeta电位仪等检测手段表征了搭建平台所需各类分子探针的稳定性，然后对探针进行组装并对组装前后的拉曼信号进行检测，通过信号值降低来评估候选化合物对PD-1/PD-L1互作过程的影响。本论文的研究结果展示了该平台成为新型的药物高通量筛选新方法的可行性与开发潜力。 在候选化合物的分子库选择方面，论文使用了组合化学多级化合物库进行筛选工作，经过大量且重复验证的筛选比对，SSF-9和SSF-13可以有效降低拉曼的特征信号峰值，即在体外水平影响PD-1/PD-L1互作，并采用多种生物学实验进行验证。与此同时，本论文利用拉曼光谱超灵敏和低背景的谱学特点，开发出了该筛选平台针对复杂化合物的分子垂钓功能。表明了HTTD-SERScreen不仅仅可用于单体抑制剂的筛选工作，也可用于混合环境下的筛选工作，为药物筛选技术开创了一个新的参考方向。 在生物活性验证阶段中，首先选择ELISA从分子水平角度探究了化合物体外对PD-1和PD-L1蛋白结合的抑制能力。实验结果表明化合物可以降低特异性蛋白识别抗体的化学发光值，分别降低了22.7%和28.66%。BMS-202作为文献报道公认的PD-L1小分子抑制剂，通过ELISA检测手段的体外抑制结合能力让化学发光值降低了39.06%，因此相比之下，认为化合物SSF-9和SSF-13具有一定的体外抑制蛋白结合的能力。为了进一步验证化合物的研发潜力，本论文又在细胞水平探究了化合物的抑制能力，在已有PD-1/PD-L1抗体类药物的常用细胞分子阻断结合模型上利用荧光素酶进行了验证。实验表明，TencentriqBiosimilar可有效阻碍PD-1/PD-L1结合，EC50值为0.1271μg/ml。BMS-202药物与化合物小分子在测定的范围内显示有一定的效果，EC50值分别为～4.096μM、~578.6μM和～4.041μM。 根据PD-1/PD-L1的免疫逃逸机理，PD-1或PD-L1抑制剂可以有效阻碍PD-1和PD-L1结合，从而调控T淋巴细胞的免疫激活效应。基于该原理，本论文首先通过用PHA激活的Jurkat细胞系模拟活化的T淋巴细胞与刺激表达PD-L1的肿瘤细胞进行共培养评估候选小分子是否具有恢复T淋巴细胞的能力。结果表明在面对不同的肿瘤细胞系时，SSF-9和SSF-13具有重新激活Jurkat细胞系的能力，对肿瘤细胞均有一定的杀伤作用。对Huh肝癌细胞的杀伤力只能达到20-30%，但是面对Hela宫颈癌细胞时，SSF-9的杀伤率达到了80%，SSF-13为40%，且杀伤能力随着药物浓度的增加呈正相关。因此在肿瘤微环境的模拟条件下，化合物有重新激活Jurkat细胞系的能力。在此条件确认下，本论文将化合物直接作用于小鼠的脾细胞环境下，在足量的PD-L1作用下，发现细胞分泌的细胞因子IL-2上清含量明显增高，这是T淋巴细胞被激活的重要指标，说明了化合物能够引起免疫细胞群的免疫刺激反应，从而恢复T淋巴细胞的免疫活性。 综上所述，本论文以表面增强拉曼为技术背景，建立了一种高通量药物筛选的方法。该平台以PD-1/PD-L1为研究目标，在化合物库中成功筛选得到了两个先导化合物SSF-9和SSF-13，同时与已有的小分子抑制剂生物BMS-202活性相比，这两个先导化合物也取得了较为理想的生物活性验证。该结果不仅为PD-1/PD-L1靶点抑制剂的开发提供了新的药物先导结构，更验证了HTTD-SERScreen作为新药研发的新方法的可行性与开发潜力。
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