摘要
细胞色素c（Cytc）是一种存在于线粒体膜间隙中的多功能蛋白质，除了作为重要的电子转移载体在呼吸链中传递电子以外，Cytc在内源性细胞凋亡途径中对凋亡的启动起到了关键作用。心磷脂（CL）是组成线粒体膜必不可少的阴离子磷脂，在维持线粒体嵴膜结构和功能中发挥着至关重要的作用。线粒体中Cytc与CL的相互作用是细胞凋亡早期阶段的重要步骤。拉曼光谱能够提供蛋白质或脂类精细的结构信息，而表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种超高灵敏的检测技术已在蛋白质研究领域显示出巨大的应用潜力。本文利用拉曼/SERS光谱探索了线粒体内Cytc和CL间的相互作用及其对细胞凋亡的调控，重点探究了不同氧化还原形式的Cytc与CL作用后对其过氧化物酶活性以及CL双分子层渗透性和有序结构的影响，揭示了线粒体内还原态Cytc在细胞凋亡启动阶段所行使的重要调控作用。主要研究成果归纳如下： 1.CL诱导的Cytc的构象改变及其过氧化物酶活性 我们在粗糙化处理的镍片表面获得了还原态Cytc的SERS光谱，证明了镍基底对Cytc的电子供体特性，同时该基底具有良好的拉曼信号增强能力。本章工作中，分别在Soret带和Q带激发下，探究了氧化态和还原态Cytc与CL脂质体结合后Cytc的构象改变及其过氧化物酶活性差异。共振拉曼（RR）/SERS结果发现，与CL结合后两种分子形式的Cytc可发生不同程度的结构重排，均呈现非天然状态，但构象转变程度更大的是还原态Cytc。还原态Cytc与CL结合后其血红素的轴向配体发生了替换，最终形成双His配位的构象异构体，而相同实验条件下氧化态Cytc的变化较小。通过监测Cytc-CL复合物催化H2O2氧化TMB或ABTS对比了不同氧化还原态Cytc的过氧化物酶活性差异。结果发现，CL脂质体诱导的还原态Cytc的过氧化物酶活性比氧化态Cytc高3倍左右。 2.Cytc诱导CL膜渗透性的改变 通过拉曼光谱研究了CL脂质体与Cytc作用后脂质体膜渗透性的改变及其对Cytc氧化还原状态的依赖。首先通过检测小分子的泄露间接判断氧化态和还原态Cytc诱导的不同程度的CL膜的渗透性。其次通过对不同氧化还原分子形式的Cytc与CL形成复合物后的SERS光谱以及透射电镜结果发现还原态Cytc可诱导更高的CL膜渗透性。进而在633nm激发线下，获得了CL丰富的拉曼指纹信息。分析结果发现还原态Cytc更容易渗入CL的非极性烷基链中，对CL双分子层的有序结构造成了更大的影响。在过氧化氢存在条件下，CL的双键发生了过氧化反应，进一步破坏了CL双分子层的有序结构。 3.Cytc-CL相互作用诱导膜形态的改变以及Cytc的释放 利用共聚焦显微成像技术，更直观地观察到了Cytc诱导的CL膜的形态变化。在还原态Cytc与含CL膜的复合物中发现脂质体表面形成了大量凹陷结构，而氧化态Cytc对磷脂膜的形态影响较小。除此之外，我们还发现在过氧化氢存在条件下，氧化态Cytc与含CL囊泡作用后表面可形成大量泡状芽孢结构，而且随着作用时间的增长，囊泡逐渐缩小。我们进一步利用SERS原位追踪了凋亡HeLa细胞线粒体中Cytc的释放，结果发现经还原剂连二亚硫酸钠处理的线粒体可明显观察到Cytc的SERS光谱，进一步证实了还原态Cytc在启动凋亡的过程中起着更重要的作用。 4.Cytc-CL相互作用调控细胞凋亡的分子机制 利用分子动力学模拟研究了Cytc和CL间的相互作用，重点探究了不同氧化还原态的Cytc与CL脂质体的结合自由能以及作用后Cytc结构的变化和主要的结合部位。结果显示氧化态Cytc在与CL作用时表现出更高的结合力，但结合后两种状态的Cytc构象变化相差甚远。与氧化态Cytc相比，还原态Cytc与CL结合后更容易插入脂质体的疏水烷基链中，而且其中心血红素的周围环境经历了更大程度的重排，肽链结构更加松散。分子动力学模拟结果进一步证明了还原态Cytc对其过氧化酶活性及CL膜的渗透性影响更大。
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