摘要
目的： 利用H9C2心肌细胞，建立缺氧复氧（hypoxia-reoxygenation,HR）损伤模型，明确线粒体未折叠蛋白反应（mitochondrial unfolded protein response，UPRmt）被激活以及UCP2在心肌细胞缺氧复氧损伤中保护效应。进一步探究UCP2通过去乙酰化酶3（Sirtuin-3,SIRT3）调控UPRmt发挥心肌线粒体保护作用机制，为UCP2发挥心肌线粒体保护性研究开拓新的思路。 方法： 1H R损伤模型摸索H9C2心肌细胞培养48小时后，细胞融合度达80%左右即可进行HR损伤处理。检测心肌细胞中UPRmt标志蛋白：热休克蛋白10(Heat shock protein10,HSP10)、热休克蛋白60(Heat shock protein60,HSP60)、线粒体ATP依赖的LON蛋白水解酶1（Lon protease1，LONP1）、线粒体酪蛋白水解酶P（Casein hydrolyzed protese P，CLPP）的蛋白表达水平探究UPRmt是否被激活，以及摸索本实验合适的HR损伤模型时间。 2心肌细胞损伤及线粒体损伤评价CCK-8（Cell Counting Kit-8）检测心肌细胞活力；用二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)荧光探针检测活性氧（Reactive oxygen species，ROS）；用JC-1探针检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,?Ψm)；用三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）检测试剂盒测定ATP含量，电镜下观察线粒体超微结构。 3线粒体未折叠蛋白反应标志蛋白检测利用Western blot检测HSP10、HSP60、LONP1、CLPP蛋白表达。 结果： 1HR损伤诱导了H9C2心肌细胞UPRmt的发生将细胞进行HR处理后检测发现，与常氧（Normal，N）组相比，在缺氧3h复氧0.5h时，UPRmt标志蛋白（HSP10、HSP60、LONP1、CLPP）表达水平明显增高。同时，细胞活力明显下降，ROS的产生明显增多，?Ψm明显下降（均plt;0.05）。说明心肌细胞HR处理影响了UPRmt，即HR损伤可诱导H9C2心肌细胞UPRmt的发生。 2UCP2过表达参与调节UPRmt，改善H9C2心肌细胞线粒体结构及功能UCP2过表达后再HR处理，与HR组相比，ROS产量减少，?Ψm增高，细胞ATP产量也增加，HSP10、HSP60、LONP1、CLPP蛋白表达水平明显增高（均plt;0.05）。比较于HR组，UCP2沉默+HR组，ROS含量明显增高，?Ψm丢失更加明显，ATP产量明显减少，HSP10、HSP60、LONP1、CLPP蛋白表达水平明显降低（均plt;0.05）。 3UCP2过表达通过激活SIRT3调节UPRmt，发挥H9C2心肌细胞线粒体保护作用将H9C2心肌细胞进行SIRT3过表达后再HR处理，与单纯HR处理组相比，ROS产量明显减少，?Ψm得到一定程度的恢复，ATP产量也有所增高，HSP10、HSP60、LONP1、CLPP蛋白表达水平明显增高（均plt;0.05）。而将SIRT3沉默组再HR处理，对比单纯HR处理，ROS增多，?Ψm进一步丢失，ATP的含量也减少，HSP10、HSP60、LONP1、CLPP表达也明显降低（均plt;0.05）。当SIRT3沉默后过表达UCP2再进行HR处理，比较于SIRT3沉默后再HR处理，ROS产量、?Ψm的丢失和ATP的产量，HSP10、HSP60、LONP1、CLPP蛋白表达水平并未得到明显的逆转（均pgt;0.05）。 结论： HR损伤诱导了H9C2心肌细胞UPRmt的发生；UCP2过表达参与调节UPRmt，改善H9C2心肌细胞线粒体结构及功能；UCP2过表达通过激活SIRT3调节UPRmt，发挥H9C2心肌细胞线粒体保护作用。
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