摘要
目的： 建立稳定的急性移植物抗宿主病（aGVHD）小鼠模型，以NLRP3炎症小体的靶向抑制剂硫藤黄菌素（THL）作为先导化合物研究其对aGVHD的防治作用并探究其作用机制。 方法： 1.使用8-10周龄雄性BABL/c小鼠作为受体，C57BL/6J雄性小鼠作为供体，移植当天受体小鼠采用6.5Gy60Co全身照射（TBI），6h后尾静脉输注供体小鼠来源的骨髓细胞1×107作为对照组，输注骨髓细胞1×107及脾细胞5×106作为aGVHD组，于移植后不同时间点观察记录各组小鼠的生存、体重变化、临床评分；移植后第11天，取对照组和aGVHD模型组小鼠肝脏及小肠进行常规组织病理学检查；移植后第11天，取aGVHD模型组小鼠外周血，分离脾脏淋巴细胞、肝脏淋巴细胞、小肠淋巴细胞，标记anti-mouse H-2Kb及anti-mouse H-2Kd，运用流式细胞学技术对aGVHD模型组小鼠进行移植嵌合率检测。 2.aGVHD小鼠实验组于移植前1天通过腹腔注射给予不同剂量THL（0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg），隔天给药一次至移植后20天，对照组给予相同体积的药物溶媒DMSO。每天观察实验组和对照组小鼠生存情况和临床表现；每周三次对小鼠进行临床评分并称取体重。于移植后第11天取小鼠肝脏，小肠，结肠组织固定、包埋、切片、Hamp;E染色进行病理学检查；于移植后第6天和第11天分离小鼠脾脏、肝脏和小肠的淋巴细胞，运用流式细胞学技术检测谱系分化、T淋巴细胞亚群及T细胞的增殖活化；酶联免疫吸附剂测定（ELISA）和细胞因子微球检测技术（CBA）检测小鼠血清中细胞因子的水平；qPCR检测靶器官组织中细胞因子mRNA的表达水平。 3.在供体和受体中分别特异性敲除THL的靶分子BRCC3，以探究BRCC3的缺失对aGVHD的作用，通过组织病理学检测靶器官损伤；酶联免疫吸附剂测定（ELISA）和细胞因子微球检测技术（CBA）检测小鼠血清中细胞因子的水平；移植后第9天分离脾脏、肝脏和小肠淋巴细胞，运用流式细胞学技术检测靶器官中T细胞的浸润和活化。 结果： 1.成功建立了稳定可靠的aGVHD小鼠模型。aGVHD模型组小鼠可观察到明显的体重下降、皮损、竖毛、弓背和腹泻等aGVHD表现，于移植后第19天全部死亡。对照组小鼠仅在移植后第10天左右有轻度的体重下降、竖毛及弓背表现，恢复后可获得长期生存；aGVHD模型组小鼠肝脏及小肠病理切片可见明显的aGVHD病理学表现，对照组小鼠未见明显的aGVHD病理特征；移植后第11天，在aGVHD模型组小鼠外周血、脾脏、肝脏和小肠嵌合率都达到95%左右。 2.在发生严重的aGVHD时，与对照组小鼠相比，THL实验组小鼠生存期显著延长，体重下降程度较轻，临床评分低于对照组。移植后11天病理检测表明THL处理组靶器官病理损伤较轻，肝脏功能检测表明肝功能好于对照组。血清中细胞因子检测结果显示在移植后的第6天，实验组IL-10、IL-17A、IL-2及TNF细胞因子水平明显降低；而在移植后的第11天，实验组IL-10、IFN-γ、IL-1β和IL-2细胞因子水平明显降低。流式细胞学检测结果显示THL不影响供体细胞在脾脏中的谱系分化和CD4+T细胞及CD8+T细胞比例，但可以降低脾脏及肝脏中T细胞的活化，抑制供体CD4+T细胞和CD8+T细胞在小肠及肝脏中的浸润，并促进脾脏及肝脏中Treg细胞的分化。qPCR结果THL可以降低靶器官中IL-1β、IFN-γ、TNF-α和IL-18等细胞因子mRNA表达。 3.在aGVHD小鼠模型中，供体BRCC3的缺失对aGVHD无明显影响，但受体中BRCC3的缺失明显加重了aGVHD。BRCC3在受体中缺失会加重靶器官肝脏的损伤，促进CD8+T细胞在靶器官中的浸润和增殖活化。 结论： THL可以显著延长aGVHD小鼠的生存期、减轻aGVHD靶器官的病理损伤、降低血清中aGVHD相关细胞因子的水平及靶器官中aGVHD相关细胞因子mRNA的表达；THL能够减少供体T细胞在靶器官中的浸润并抑制供体T细胞活化、增加靶器官Treg细胞分化从而延缓aGVHD的发生发展。但是，THL的靶分子BRCC3在受体中敲除会加重aGVHD，表明THL减轻aGVHD的作用可能不是通过BRISC复合体实现的。
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