摘要
近年来，靶向免疫检査点的免疫疗法在针对多种实体瘤中取得了巨大的成功。已经有多款免疫检査点抑制剂被批准应用于治疗多种实体瘤和血液瘤，由于对该领域的突出贡献，James Allison和Tasuku Honjo教授获得了2018年的诺贝尔生理学或医学奖。随着临床研究的不断深入，人们也开始寻找新的免疫检査点或者新的联合治疗策略。脊髓灰质炎病毒受体相关的含有免疫球蛋白结构域蛋白(Poliovirus receptor-related immunoglobulin domain-containing protein,PVRIG)作为最近在T细胞和自然杀伤（Nature killer,NK)细胞上发现的抑制性受体，与其配体结合之后能够抑制T细胞受体（T cell receptor,TGR)信号从而抑制T细胞的效应功能，导致T细胞的耗竭，进而促进肿瘤的发展。作为抗肿瘤重要的NK细胞，其功能是否也受PVRIG分子的调控目前尚不清楚;PVRIG分子是否影响NK细胞的耗竭以及PVRIG分子对NK细胞抗肿瘤功能的影响等均有待进一步的研究。 在本研究中，我们通过制备筛选特异性阻断PVRIG分子与其配体结合的单克隆抗体对PVRIG分子在肿瘤微环境中所发挥的作用进行了研究，并探讨了NK细胞在靶向PVRIG分子治疗中的重要性。主要获得了以下六个方面的结果: 1、PVRIG基因表达载体构建及蛋白表达 我们分别构建了pLVX-EF1α-mPVRIG载体、pLVX-mPVRIG-hFc载体以及pLVX-mCD112-hFc载体，并在293T细胞系中过表达了mPVRIG蛋白，mPVRIG-hFc融合蛋白以及mCD112-hFc融合蛋白。对亲和层析得到的融合蛋白进行了纯度以及序列的鉴定，证明我们得到的mPVRIG-hFc融合蛋白可以用来进行单克隆抗体的制备。 2、Anti-PVRIG单克隆抗体的制备及筛选 我们采用mPVRIG-hFc融合蛋白免疫大鼠，对杂交瘤细胞培养上清进行筛选，发现编号为12D9克隆能够阻断PVRIG分子与其配体CD112分子的结合，将该杂交瘤细胞培养，收集上清进行protein G亲和层析，得到12D9单克隆抗体，对抗体的阻断功能和特异性进行了验证，测定了12D9抗体的CDR序列以及与mPVRIG-hFc融合蛋白结合的亲和力。结果表明我们制备并筛选了可以用于体内治疗实验的阻断性的anti-PVRIG单克隆抗体，为探究PVRIG信号对免疫系统功能的影响提供了基础。 3、PVRIG分子在肿瘤浸润的NK细胞上高表达 为了确定PVRIG-CD112这对受配体在肿瘤微环境中的表达情况，我们对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库进行分析，发现CD112分子在多种肿瘤组织中都高表达。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC)染色结果表明结肠腺癌患者组织高表达CD112分子，且患者肿瘤浸润的淋巴细胞表面表达PVRIG分子。进一步分析，发现PVRIG的基因表达与其他免疫检査点如PDCD1、TIGIT,CD96等基因的表达成正相关，而与患者的生存预后成负相关。我们在多种小鼠皮下瘤模型中，也发现肿瘤浸润的NK细胞表面高表达PVRIG分子，并且PVRIG+NK细胞具有更加耗竭的表型，与肿瘤患者中得到的结果一致。以上结果提示PVRIG分子的存在与NK细胞的耗竭有关。 4、PVRIG分子缺失抑制肿瘤浸润淋巴细胞耗竭和肿瘤生长 为了进一步探讨PVRIG对淋巴细胞抗肿瘤功能的影响，我们使用Pvrig-/-小鼠构建皮下瘤模型，与正常小鼠对比，发现PVRIG缺失之后能够显著抑制多种皮下瘤的生长，并且小鼠的生存期显著延长。此外，肿瘤浸润的NK细胞和CD8+T细胞的效应功能也得到了恢复。 5、PVRIG阻断逆转肿瘤浸润淋巴细胞耗竭并抑制肿瘤生长 我们使用PVRIG分子的特异性阻断抗体12D9对正常小鼠皮下瘤进行干预，观察小鼠肿瘤生长情况。发现阻断PVRIG能够有效抑制MC38皮下瘤的生长并且延长小鼠的生存期。进一步研究表明，阻断PVRIG分子取得的治疗效果主要是由于逆转了肿瘤浸润NK细胞和CD8+T细胞的耗竭，并促进CD4+T细胞向Th1细胞分化，从而增强了系统性的抗肿瘤免疫应答。此外，同时靶向PVRIG分子和PD-L1分子的治疗取得了更好的疗效，进一步抑制肿瘤的发展。 6、PVRIG阻断抑制肿瘤生长依赖于NK细胞和CD8+T细胞 在MC38结肠癌模型中，我们分别清除NK细胞和/或CD8+T细胞，发现PVRIG阻断抗体的治疗无效，小鼠肿瘤的生长都明显加快。在适应性免疫缺陷的Rag1-/-鼠中，使用PVRIG阻断抗体治疗，依然能够抑制肿瘤的发展。这些结果表明PVRIG阻断抗体的疗效依赖于NK细胞和CD8+T细胞，更重要的是NK细胞可以不依赖于适应性免疫系统响应PVRIG阻断抗体的治疗。 抑制性受体PVRIG分子参与介导了NK细胞的耗竭，并且anti-PVRIG抗体治疗增强机体抗肿瘤免疫应答是通过作用于NK细胞和CD8+T细胞实现的，二者在anti-PVRIG抗体治疗过程中都发挥了非常重要的作用。我们的研究揭示了NK细胞在靶向PVRIG治疗中的重要性，对靶向PVRIG药物的临床应用提供了理论基础，具有重要的指导意义。
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