摘要
酿酒酵母作为历史悠久的生活生产菌株，与人类的生产活动关系密切。由于其遗传背景清晰、易于培养、具有生物安全性等优点，广泛应用于高附加值代谢产物的生物合成。酪醇及其衍生物红景天苷因具有消炎、抗肿瘤、保护神经、保护心血管等医疗效用而需求量大增，生物合成因其绿色可持续的特性成为当前广受关注的研发重点。 以酿酒酵母为底盘细胞合成酪醇及红景天苷衍生物取得了一定进展，但依然存在莽草酸途径碳流量水平低、E4P供应量不足、乙醇等副产物大量积累、UGT酶转化率和专一性低等关键技术瓶颈。针对以上关键技术瓶颈，本研究对底盘细胞进行了理性设计及代谢工程改造，以期获得高产酪醇和红景天苷酿酒酵母工程菌株 本研究以课题组已经构建的酪醇生产菌株DA-1菌株为底盘细胞，首先解除芳香族氨基酸对酪醇生物合成途径关键酶的反馈抑制，在aro3位点导入芳香族氨基酸反馈抑制突变体ARO4K229L和ARO7G141S，获得DAY-1菌株的酪醇产量提高了65.29％。敲除高糖酵解途径的转录激活因子Gcr2，菌株DAY-2-22的生长没有受到影响，但其酪醇产量也没有得到明显改善。在adh1位点上过表达ADH2，使得碳流量从乙醇逆转至莽草酸途经，引入ADH2后的转化子DAY-2-24的酪醇产量提高15.41％。为了减少芳香族氨基酸生物合成副产物的生成，选择在菌株DAY-1敲除邻氨基苯甲酸盐合成酶基因TRP3(DAY-2-26)与预苯酸脱水酶基因PHA2(DAY-2-27)，DAY-2-27的酪醇产量提高了49.08％，达到1.05±0.05g/L。为了增加E4P的供应量，引入外源磷酸酮醇酶xfpk的E4P生成途径，在菌株DAY-1的pha2位点引入来自短双歧杆菌xfpk，摇瓶发酵96h菌株DAY-2-29的酪醇产量提高了107.87％，产量达到1.410±0.03g/L，从头合成得率为0.49mg酪醇/g葡萄糖/h。 来自红景天的U8GT33酶经报道有较高的转化率，将RrU8GT33导入酪醇高产菌株DAY-2-29的trp3位点中获得红景天苷生成菌株DAY-3-2，摇瓶发酵96h红景天苷产量达到2.77g/L，从头合成得率为0.96mg红景天苷/g葡萄糖th。利用酿酒酵母表面系统“sss盒”，尝试将U8GT33展示到菌株DAY-1细胞表面，将分泌到胞外的酪醇转化完全。摇瓶发酵结果显示，培养U8GT33表面展示菌株DAY-2-12时菌体易沉底，96h生成1.25g/L红景天苷，可见RrU8GT33展示到细胞表面依然保持较高的催化效率。
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