摘要
研究背景：儿童青少年非酒精性脂肪肝病（nonalcoholicfattyliverdisease,NAFLD）是指未成熟个体（＜18岁）肝脏的慢性脂肪变性。按照时间发展的先后顺序，由轻到重。最轻为单纯性非酒精性脂肪肝（nonalcoholicfattyliver,NAFL）；其次是非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholicsteathepatitis,NASH）以及最严重的NASH相关性肝硬化，部分进一步发展为肝硬化甚至肝细胞性肝癌。但是随着对了解的加深，医学家和科研工作者们意识到NAFLD是代谢性病变，除了肝脏本身因脂肪累积造成的脂肪变性，甚至肝硬化之外，由于脂肪代谢紊乱造成的全身脏器的损伤，逐步出现高血脂、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等多种更严重的代谢相关的心血管疾病。因为对疾病认识的不足和该病的发病隐匿的临床特点，更多人忽视NAFLD带来的危害。 儿童青少年非酒精性脂肪肝的发病机制暂时还没有定论，比较流行的观点是“二次打击学说”、“多重打击学说”。其中第一次打击是肯定的，即肝脏脂肪堆积，脂肪酸进入线粒体中氧化分解，再合成胆固醇、三酰甘油。众所周知，NAFLD最初期是单纯性脂肪肝，第二阶段才是NASH，所以究竟是什么参与第二阶段脂肪炎症的过程，HFD饮食是否可以参与NAFLD机制的发生发展，暂时机制还不清楚，但ROS参与的氧化应激以及脂质过氧化反应是目前研究“多重打击学说”的十分热点的话题。那么如果能在氧化应激及脂质过氧化反应过程中寻找到发病机制为我们进一步干预NAFLD提供了更加明确的作用靶点。有可能通过改善氧化应激可以起到改善NAFLD的作用。 很长时间以来，硫化氢（hydrogensulfide，H2S）一直扮演坏的角色。近些年，随着对该气体的深入研究发现，H2S是新型的内源性气体递质。H2S参与许多人体的生理功能的调节，包括氧化应激、糖脂代谢、心血管系统、分化和昼夜节律的调节。许多研究都表明，H2S与肝纤维化、肝硬化、肝癌、肝缺血/再灌注损伤、非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎、肝毒性、急性肝衰竭等多种肝脏疾病的发病机制有关。H2S可通过多条信号通路缓解氧化应激，进而减少肝脏脂质蓄积。近年来逐步发现H2S在保护线粒体方面也有很明确的作用。但H2S为气体分子，我们不能很好的控制其释放的浓度，浓度过高可能达到毒理效应浓度，而浓度太低，达不到药理有效浓度。而且该气体具有挥发性，在体内不易定位，也不能很好控制该气体到达关注相关靶器官的浓度，这极大限制了H2S气体本身作为药物在基础研究和临床试验中的应用。所以限制H2S的应用，所以寻找正确的H2S供体来研究H2S和NAFLD之间发生的机理不但有助于人们认识H2S在NAFLD中的作用，更能为临床药物研究提供理论依据和指南。而AP39（10oxo-10-（4-（3-thioxo-3H-1,2-dithiol-5yl）phenoxy）decyl）是一种线粒体H2S靶向供体，是将5-对羟基苯基-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮类化合物（ADT-OH）和具有线粒体靶向性的基团三苯基膦结合形成的衍生物，可以使供体集中在线粒体中，增加线粒体H2S的浓度。有研究指出AP39在心脏缺血再灌注、阿尔兹海默病等均有器官保护作用。但目前暂无AP39在NAFLD中的应用。 目的：构建幼年非酒精性脂肪肝病大鼠模型，探讨高脂饮食对对非酒精性脂肪肝病动物模型肝脏大体影响，肝功能、血脂等相关血清学指标的影响，测定H2S水平及氧化应激标志物；探讨AP39对非酒精性脂肪肝病动物模型线粒体功能、HIF-1α以及mtDNA的影响。 研究方法：选择雄性健康的3周龄SD大鼠24只，随机平均分成四组，A:对照组（Control组）、B:HFD组、C:HFD:HFD+L-AP39组、D:HFD+H-AP39组。Control组进行标准饮食饲养，其他三组进行高脂饲料喂养，HFD组每天尾静脉注射与AP39组同等剂量的生理盐水，HFD+L-AP39组每天尾静脉注射AP39，剂量为0.05mg/kg；HFD+H-AP39组每天尾静脉注射AP39，剂量为0.1mg/kg，均记录体重变化与食物摄入量，每周一次，连续7周。比较四组大鼠体重变化、造模结束后记录大鼠大体肝脏肝指数、NAFLD活性度评分、肝脏HE染色、油红O染色区别。分别测定ALT/AST、TC/TG、LDL-C/HDL-C、H2S、MDA、SOD及GSH。利用DHE染色方法检测ROS水平，荧光酶标仪检测SD大鼠线粒体膜电位，利用520nm吸光值判定线粒体肿胀程度。RT-PCR检测mtDNA拷贝数水平及Westernblot检测组织中HIF-1α蛋白质表达，同时使用RT-PCR测定HIF-1αmRNA水平。 结果： 1.造模第7周，四组SD大鼠体重分别为Control组：291.5±54.1g，HFD组：409.3±47.3g；HFD+L-AP39组：354.5±30.1g；HFD+H-AP39组：310.7±22.2g。HFD+H-AP39组的平均体重已基本接近Control组。自喂养第3周至第7周，HFD明显降低了大鼠的摄食量。到第7周结束时，HFD组SD大鼠的摄食量为20.8±3.3g，而Control组正常饮食的SD大鼠摄食量为26.2±4.1g；而AP39处理的SD大鼠的摄食量除第五周外，均呈增加趋势，但不显著。在第7周，HFD+L-AP39组、HFD+H-AP39组摄食量分别是23.7±2.0g和24.5±1.5g。 2.HFD组肝脏体积明显增大，NAFLD活性评分为9分，均同时具备肝脂肪变性、小叶炎症以及肝细胞气球样变的典型NAFLD的病理特征。经过AP39不同剂量干预的大鼠肝脏均为黄红色外观，但体积较正常肝脏增大，肝脏脂肪堆积程度比HFD组明显改善，黄色脂肪部分减少。正常饮食组肝指数平均值为3.07±0.277；HFD组4.03±0.505；HFD+L-AP39组3.49±0.265；HFD+H-AP39组3.25±0.155。 3.正常进食的对照组肝功能平均值分别为ALT:55.176±11.636U/L，AST：108.417±23.236，HFD组肝酶明显升高，结果提示ALT为176.263±43.82U/L,AST为269.659±55.97U/L；与HFD组相比，AP39干预后两组均有明显差异，AST、ALT明显下降； 4.正常进食的对照组TG\TC分别是0.821±0.208mmol/l，2.02±0.448mmol/l。HFD组TG：2.821±0.587mmol/l，TC：6.17±1.476mmol/l），AP39干预后的两组和HFD组相比较,TG/TC明显下降。 5.HFD组LDL-C显著增高，与对照组（0.301±0.064mmol/l）相比差异有统计学意义；与HFD组（1.007±0.222mmol/l）比较，AP39干预后的两组均有显著差别，此差异有统计学意义；与对照组（1.293±0.29mmol/l）相比，HFD组HDL-C明显降低，差异有统计学意义；与HFD（0.529±0.110mmol/l）组相比，AP39干预后两组均有明显差异，且差异有统计学意义。 6.正常饮食的对照组H2S为0.104±0.022umol/mgprotein，HFD组H2S水平明显降低（0.046±0.013umol/mgprotein），差异有显著统计学意义。与HFD组相比，AP39干预后HFD+L-AP39组H2S（0.076±0.018umol/mgprotein）水平升高，与HFD组比无统计学差异，HFD+H-AP39组H2S（0.091±0.019umol/mgprotein）水平显著升高，差异有显著统计学意义。 7.对照组MDA2.014±0.536nmol/mgprot，HFD组MDA明显提高，数值高达7.119±1.716nmol/mgprot，差异有统计学意义；与HFD组相比，AP39干预后的两组MDA大幅下降，分别为5.129±1.186nmol/mgprot、4.046±1.047nmol/mgprot，且差异有统计学意义；对照组GSH、SOD分别为19.915±4.345μmol/gprot，69.868±14.286U/mgprot，HFD组GSH、SOD明显降低，分别为6.772±1.927μmol/gprot，27.096±6.013U/mgprot，差异有统计学意义。与HFD组相比，AP39干预后两组GSH、SOD升高，且差异有统计学意义。 8.DHE染色显示，正常对照组细胞仅有较低荧光强度，HFD组细胞有较强红色荧光，经过L-AP39干预后，较HFD组ROS细胞荧光强度减，而HFD+H-AP39组较HFD组ROS细胞荧光强度减弱，同时显示红色荧光细胞数目减少明显。 9.线粒体肿胀可以通过520nm吸光值来判断。对照组线粒体在520nm的吸光值是0.377±0.078。HFD组520nm吸光值明显减低（0.125±0.032），与正常对照组相比，差异有统计学意义；而AP39干预后两组与HFD组比较均有明显差异，HFD-L-AP39组520nm吸光值为0.228±0.053；HFD-H-AP39组520nm吸光值为0.298±0.070；差异有统计学意义。 10.对照组MMP2.479±0.652?Ψm，HFD组MMP明显降低，0.509±0.112?Ψm，差异有统计学意义；与HFD组相比，AP39干预后的两组均有明显差异，分别为1.279±0.333?Ψm和1.701±0.436?Ψm，MMP明显升高； 11.RT-PCR荧光定量显示与对照组（1.0±0.04）相比，HFD组HIF-1αmRNA水平（4.0±0.16）明显升高，差异有统计学意义；与HFD组相比，AP39干预后的两组HIF-1αmRNA水平（分别为3.11±0.32、1.86±0.13）明显下降，与HFD组差异有统计学意义； 12.通过westernblot检测HIF-1α蛋白表达量，与对照组相比，HFD组HIF-1α蛋白水平明显升高（蛋白表达量为5.46），差异有统计学意义；与HFD组相比，AP39干预后的两组HIF-1α蛋白水平明显下降（蛋白表达量分别为3.44、1.88），与HFD组差异有统计学意义。 结论： 1.AP39以剂量依赖的方式降低HFD诱导的SD大鼠体重增加，其中AP39高剂量组比AP39低剂量组幼鼠体重增加幅度慢，AP39可以控制HFD喂养SD大鼠体重的增长。AP39在儿童肥胖中是可以有潜在作用的。AP39干预后可减少肝指数，AP39在体内对高脂饮食引起的肝细胞损伤有保护作用。AP39干预后肝脏可见到明显的脂肪变性，肝脏内脂质浸润面积和脂质空泡面积增加，同时伴肝细胞体积增大。 2.AP39能够提高NAFLD大鼠的肝功能、降低血脂、胆固醇及LDL-C。可以有效抑制HFD喂养的幼年大鼠的脂质积累。而HDL-C结果相反,这与NAFLD患者的血脂变化是一致的，说明NAFLD动物模型不仅具有病理学改变，脂质沉积，同时有肝功能、血脂的变化，而且同人类NAFLD血清学改变一致。 3.AP39可以提高HFD+H-AP39组及HFD+L-AP39组H2S水平。另外AP39可以降低MDA水平；经AP39干预后的HFD+H-AP39组及HFD+L-AP39组GSH水平和SOD活性均有提高,说明了AP39的抗氧化作用。 4.可以通过DHE染色方法来检测ROS水平，DHE染色显示，HFD导致ROS产生增加，而AP39可消除ROS的荧光强度。AP39增加了520nm处的吸光度，表明HFD诱导的线粒体肿胀得到了改善。在一般情况下，MMP能够支持线粒体内发生氧化磷酸化，并产生大量ATP。与正常饮食组相比，在HFD组MMP明显降低。AP39干预后MMP明显升高，差异有统计学意义。说明与HFD喂养的大鼠相比,AP39处理的HFD大鼠MMP损失减少。 5.AP39可以增强mtDNA拷贝数水平，AP39显著下调肝脏HIF-1αmRNA，降低HIF-1α蛋白表达水平。
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