摘要
背景： 肿瘤通过分泌外泌体来介导肿瘤微环境中肿瘤细胞与免疫细胞的之间的信息传递。外泌体中的miRNA通过抑制免疫细胞mRNA的翻译来影响免疫细胞的极化。在肿瘤微环境中，肿瘤来源的外泌体miRNA可能通过抑制T细胞的活化，从而促进了肿瘤的发生发展，协助肿瘤免疫逃逸的发生。本课题组前期通过对肺癌患者血浆来源的外泌体miRNA进行测序，并在肺癌细胞系的上清中检测差异表达的miRNA含量，最终选择出两个新发现的高表达miRNA(暂定名为miRNA-A和miRNA-B)，在本研究中我们研究了miRNA-A和miRNA-B对T细胞活化的抑制作用及作用机制。 方法： 1)首先收集肺腺癌细胞系H1975和支气管上皮细胞Beas-2B的细胞上清，利用聚乙二醇法提取外泌体，并进行外泌体鉴定（透射电镜观察外泌体的大小和形状、ns300纳米颗粒跟踪分析仪分析颗粒大小分布、WesternBlot检测外泌体标志物TSG101和CD63、qPCR检测每微克蛋白质miRNA-A和miRNA-B的相对表达量）； 2)从H1975提取的外泌体是否对T细胞的活化有抑制作用，并观察miRNA-A和miRNA-B的抑制物验证外泌体抑制作用是否与miRNA-A和miRNA-B有关； 3)转染不同浓度miRNA-A和miRNA-B，在不同的时间点收集细胞，提取RNA检测T细胞活化的标志性分子，从而确定最佳作用剂量为200pmol，最佳作用时间是72h； 4)最佳转染条件下，转染miRNA-A和miRNA-B，qPCR和ELISA检测T细胞活化的标志性分子，流式细胞术和免疫荧光检测T细胞的活化比例；确定miRNA-A和miRNA-B对T细胞活化的抑制作用； 5)通过靶基因分析初步筛选miRNA-A和miRNA-B作用的共同靶基因，qPCR和WesternBlot检测出两个降低更为明显的靶基因； 6)siRNA敲低靶基因后，同样用qPCR和ELISA检测T细胞活化的标志性分子，流式细胞术和免疫荧光检测T细胞的活化比例，从而确定miRNA-A和miRNA-B通过作用于这两个靶基因来抑制T细胞的活化； 7)高通量转录组测序敲低靶基因的Jurkat-T细胞，探索靶基因抑制T细胞活化的相关通路。 结果： 1)源自H1975细胞的外泌体对T细胞活化有明显抑制作用，且miRNA-A和miRNA-B特异的抑制物降低了miRNA-A和miRNA-B对T细胞活化的抑制作用，表明外泌体的抑制作用是通过miRNA-A和miRNA-B来实现的。 2)以最佳转染条件转染miRNA-A和miRNA-B。qPCR、ELISA、流式细胞术和免疫荧光检测表明T细胞活化的标志性分子TNF-α、IL-2、IFN-?、CD40L表达下降以及活化T细胞比例下降； 3)由于miRNA-A和miRNA-B对T细胞活化的相似性，通过miRanda进行靶基因分析，挑选出的32个共同靶基因，qPCR和WesternBlot检测显示TRIOBP和NFATC1表达量下降；显示TRIOBP和NFATC1可能为miRNA-A和miRNA-B的共同靶基因； 4)进一步采用siRNA敲低TRIOBP和NFATC1后，qPCR和ELISA检测T细胞活化的标志性分子表达下降，流式细胞术和免疫荧光检测活化T细胞比例下降，说明miRNA-A和miRNA-B是作用于TRIOBP和NFATC1起作用的。 5)将敲低TRIOBP和NFATC1的Jurkat-T细胞进行高通量测序后，发现共同升高的基因有71个，共同下降的基因有33个；通过对Th1和Th2细胞的分化进行分析，qPCR检测IL-4R的表达量，发现其升高；对IL-4R相关通路进行分析，两个靶基因可能共作用于AKT通路。 结论： 肿瘤来源的外泌体miRNA通过作用于靶基因TRIOBP和NFATC1抑制T细胞的活化，而TRIOBP和NFATC1可能共同作用于AKT通路。
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