摘要
目的修复外伤、感染、坏死、肿瘤切除术等常见原因造成的骨缺损仍是临床上一个较大的挑战。小范围的骨缺损可以实现自愈，而较大范围的缺损如临界骨缺损难以实现自愈，往往需要外部的干预治疗。临床常见的骨缺损修复策略如同种自体骨移植、同种异体骨移植以及人工骨植入等具有一定的局限性，可造成手术供区的功能畸形、移植体对缺损部位较差的适应性等。骨组织工程近年来作为研究的热点，在修复骨缺损领域具有一定的潜力。支架作为骨组织工程的重要组成之一，能够替代并发挥天然骨移植体的作用。然而目前常见的支架具有一定的局限性，例如硬度过高、弹性性能差，缺乏孔径结构或孔径结构设计不合理等，可能引发支架的断裂或者支架中心营养缺乏，继而导致较差的修复效果甚至引起周围天然骨组织的吸收。此外，形状记忆能力和形状恢复能力可以保证支架能够以微创的方式植入体内并且自适应缺损的形状，在组织工程领域具有重要的作用。壳聚糖（Chitosan,CS）作为常见的天然多糖具有良好的生物相容性、降解性和抗菌性等被广泛应用于骨组织工程中，此外壳聚糖还具有良好的形状记忆能力。β-磷酸三钙（β-tricalciumphosphate,β-TCP）具有良好的生物相容性和骨传导性而被广泛应用于骨缺损修复中。本研究通过双向冷冻干燥技术制备了壳聚糖-β-磷酸三钙（Chitosan-β-tricalciumphosphate,CS-β-TCP）弹性支架，对其结构和性能进行表征，并检测其生物相容性和促进成骨分化的能力，探索其作为修复骨缺损支架的可行性，并讨论该支架在微创、大段骨缺损以及作为载体等领域的潜在价值。 方法配置1%的CS溶液，将β-TCP纳米颗粒混入CS溶液中，使用超声震荡仪震荡30min，使β-TCP纳米颗粒均匀分散于CS溶液并通过双向冻干技术制备CS-β-TCP支架。使用扫描电子显微镜（Scanningelectronmicroscope，SEM）观察该支架的微结构；能量分散光谱（EnergyDisperseSpectroscopy,EDS）和X射线衍射（X-raydiffraction,XRD）分别对支架进行元素分布和组成成分的分析、力学万能仪测试支架压缩强度。将骨髓间充质干细胞（bonemesenchymalstemcells,BMSCs）接种于CS-β-TCP支架并共培养1，4，7d后，使用CCK-8法检测该CS-β-TCP支架的生物相容性，BMSCs的细胞活力则用活死染色试剂盒进行检测。为探究该支架的体外矿化能力，将CS-β-TCP支架浸泡于SBF溶液中7d后采用SEM观察其表面矿化情况，并使用XRD分析晶相的成分。BMSCs胞接种于CS-β-TCP支架并共培养72h后，分别使用DAPI（4'',6-二脒基-2-苯基吲哚）和鬼笔环肽（Phalloidin）染液对细胞核和细胞骨架进行染色处理，使用激光扫描共聚焦显微镜（Confocallaserscanningmicroscope,CLSM）检测BMSCs在支架表面的黏附情况。荧光定量PCR（q-PCR）法检测成骨相关基因：骨形态发生蛋白（Bonemorphogeneticprotein2,BMP2）,Runx相关转录因子2（Runxfamilytranscriptionfactor2,RUNX2）和Ⅰ型胶原（CollagentypeI,COL1）的表达，碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,ALP）染色检测BMSCs的成骨分化效果。 结果扫描电镜结果显示CS-β-TCP支架呈平行排列的薄层状结构，疏松多孔，β-TCP颗粒均匀的分布在壳聚糖骨架上，CS-β-TCP支架具有良好的弹性性能、形状记忆能力，被压缩后可以恢复到初始形状。体外矿化结果表明，CS-β-TCP支架具有一定的生物活性，SEM结果可观察到β-TCP颗粒周围沉积针状矿化物，XRD物相分析表明矿化物质为羟基磷灰石。CCK-8实验结果表明，CS-β-TCP支架的吸光度值与对照组无统计学差异，具有良好的生物相容性，活死染色结果表明CS-β-TCP支架上细胞具有较高的细胞活性。q-PCR结果表明，与未加入β-TCP的阴性对照（纯CS组）相比，CS-β-TCP组的BMP2、RUNX2、COL1基因均显著性上调，且CS-β-TCP组的ALP染色阳性结果更为明显，表明CS-β-TCP支架能够促进BMSCs的成骨向化。 结论CS-β-TCP支架具备优异的机械性能和生物性能，能够诱导间充质干细胞向成骨方向分化，为骨缺损的修复研究提供了一种可行的方法，并且为不规则缺损的修复和微创手术提供了一种新的思路。
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