摘要
目前，肿瘤的治疗包括传统疗法，如手术治疗、放疗和化疗，以及新兴的治疗策略——遗传疗法和肿瘤免疫疗法，其中肿瘤免疫治疗主要包括抗体治疗、细胞免疫治疗和细胞因子治疗，旨在增强抗肿瘤免疫，及时有效地清除癌细胞。肿瘤免疫疗法在实践中呈现出传统治疗手段无可比拟的优势，对肿瘤患者健康器官损伤小，治疗过程中产生的不良反应小，对残存的肿瘤细胞清除更加有效。在肿瘤微环境中，发挥抗肿瘤免疫作用的细胞主要包括T细胞、B细胞、巨噬细胞等。由肿瘤细胞募集和激活的免疫细胞及相关基质成分在肿瘤的生长早期阶段开始聚集，形成了抑制肿瘤生长的肿瘤免疫微环境。但是，随着持续的肿瘤抗原刺激和免疫激活，肿瘤免疫微环境中的抗肿瘤免疫效应分子和细胞被消耗殆尽，形成了一种免疫抑制性的肿瘤免疫微环境，反而促进了肿瘤的免疫逃逸。在肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、纤维肉瘤以及乳腺癌等多个不同的肿瘤类型中，均存在免疫抑制的肿瘤免疫微环境以及肿瘤免疫逃逸现象。因此，恢复肿瘤免疫微环境的抗肿瘤能力，加强抗肿瘤免疫，是肿瘤免疫疗法的关键。尽管目前已经有免疫治疗药物可以刺激肿瘤反应性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），并对部分患者有效，但是这些药物在治疗过程中时常会发生获得性耐药。因此，需要开发新的策略诱导抗肿瘤免疫来改善患者的预后。 转化生长因子β（TGF-β）是一种多功能的调节细胞因子，通过调节淋巴细胞的增殖、分化和生存来维持免疫系统的耐受性。此前的研究表明，TGF-β具有抑制T细胞增殖分化为辅助型T细胞（Th）和CTL，以及抑制抗原提呈细胞对T细胞的刺激等功能。在TGF-β存在下的条件下，活化的CD8+T细胞未获得CTL功能，这可能是因为TGF-β抑制了多种CTL效应分子的表达，包括颗粒酶A（GzmA）、颗粒酶B（GzmB）、穿孔素（Prf）和γ干扰素（IFN-γ）。总之，这些发现共同证明了TGF-β在肿瘤逃逸中的作用，提示TGF-β可能是肿瘤免疫治疗的靶点。TGF-β中和抗体治疗和TGF-β阻断药物已取得一定效果，但仍有相当比例的肿瘤不能通过中和抗体或小分子药物获益。 常用于TGF-β阻断的免疫治疗药物，如中和抗体等，通常不具有细胞选择性。虽然这些药物可以作用于所有TGF-β反应细胞，阻断其TGF-β信号，进而在一定程度上改变了肿瘤微环境。但是，这种非选择性的阻断TGF-β信号所导致肿瘤微环境中的关键免疫细胞如T细胞的变化有限，因此，该方式获益局限，不良反应较大。考虑到TGF-β信号实现免疫抑制和肿瘤免疫逃逸的主要手段是通过抑制T细胞的增殖和分化的T细胞成Th和CTL，选择性针对T细胞抑制TGF-β信号可能是一个有效的策略以诱导抗肿瘤免疫，抑制肿瘤逃避。此外，TGF-β在调节性T细胞（Tregs）的发育、维持和诱导中的功能也备受关注。TGF-β在体外已证实能促进CD4+T细胞向Tregs转化，但生理条件下TGF-β对Tregs的作用仍存在争议。Tregs可积极抑制免疫反应，维持免疫耐受，在肿瘤逃逸中发挥作用。因此，靶向T细胞特异性抑制TGF-β信号转导是否会导致Tregs的改变进而影响抗肿瘤免疫值得关注。 T-bet是一类转录因子，由Tbx21基因编码，是T-box家族转录因子中的一员。前期研究表明，TGF-β抑制T-bet的表达，从而抑制CD4+T细胞的分化。此外，T-bet转录调控CTL的编码效应分子GzmA、GzmB，穿孔素和IFN-γ进而影响T细胞的分泌。因此，消除TGF-β介导的T-bet抑制，可能导致GzmB、IFN-γ等效应分子合成增加，进而诱导T细胞抗肿瘤免疫。 在本文中，课题组使用了一种转基因小鼠，该小鼠在CD4启动子的控制下过表达一种显性失活TGF-β受体Ⅱ型（dnTGF-βRⅡ）质粒，进而导致其T细胞亚群对TGF-β信号不敏感，并且不会影响该小鼠体内其他细胞对TGF-β信号的反应性。由于在肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、纤维肉瘤以及乳腺癌等多个不同的肿瘤类型中，均存在免疫抑制的肿瘤免疫微环境以及肿瘤免疫逃逸现象，因此本文试图利用肺癌细胞株LLC和纤维肉瘤细胞株MCA205，在野生型（WT）小鼠和dnTGF-βRⅡ小鼠上建立肺癌及纤维肉瘤荷瘤模型，探讨靶向T细胞特异性阻断TGF-β信号是否能增强抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，并探讨其机制。结果证实，靶向T细胞特异性阻断TGF-β信号可以抑制肿瘤生长，减轻小鼠的荷瘤负担；此外，靶向T细胞特异性阻断TGF-β信号可以促进T细胞增殖，显著增加CD4+、CD8+T细胞和效应T细胞的水平，显著增强CTL的应答，这可能与T-bet表达上调有关。此外还发现T淋巴细胞中TGF-β受体Ⅱ型显性失活降低了荷瘤小鼠肿瘤组织和脾脏中Tregs水平，这可能是恢复免疫功能，增强抗肿瘤作用的原因之一。总之，研究结果表明，靶向T细胞特异性阻断TGF-β信号通路，可以改变免疫应答的平衡，有利于抗肿瘤免疫，提示其具有很强的治疗潜力。 目的： 明确靶向T细胞特异性阻断TGF-β可以增强抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，并明确其增强抗肿瘤免疫的机制，将为靶向抗肿瘤免疫疗法提供新的证据和实验基础。 方法： 小鼠皮下荷瘤模型的建立与肿瘤负荷评估：由于肺癌和纤维肉瘤的发生发展过程中存在着免疫抑制的肿瘤免疫微环境以及肿瘤免疫逃逸现象，因此本文试图利用肺癌细胞株LLC和纤维肉瘤细胞株MCA205，在WT和dnTGF-βRⅡ小鼠上建立肺癌及纤维肉瘤荷瘤模型，探讨dnTGF-βRⅡ是否能增强抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长，并探讨其机制。随机挑选一定数量的同窝WT小鼠与dnTGF-βRⅡ转基因小鼠，分为WT组和dnTGF-βRⅡ组。取1×106处于对数生长期的小鼠肺癌细胞株LLC分别接种在两组小鼠的背部皮下，待小鼠背部肿瘤生长至肉眼可见时，每隔一天记录小鼠的体重和肿瘤体积变化，直至小鼠背部皮下肿瘤体积最大达2000mm3时，处死小鼠。另取相同数量的同窝WT小鼠和dnTGF-βRⅡ转基因小鼠，同样的方法背部皮下接种1×105处于对数生长期的小鼠纤维肉瘤细胞株MCA205，同样的方法操作记录并小鼠的肿瘤生长。处死小鼠后，剪开其背部皮肤，剥离肿瘤组织，称重并记录。HE染色检测小鼠肿瘤组织的病理特征，免疫组化检测Caspase-3的表达，TUNEL染色及激光共聚焦显微镜观察小鼠肿瘤组织中细胞凋亡情况，Ki67染色检测并进行半定量分析小鼠肿瘤组织中细胞的增殖水平。 小鼠抗肿瘤免疫的检测与评估：为了明确dnTGF-βRⅡ对小鼠T细胞亚群以及CTL功能的影响。对小鼠肿瘤组织采用胶原酶消化法和密度梯度离心的方法，对小鼠脾脏组织采用研磨和密度梯度离心的方法，分别从小鼠的肿瘤组织和脾脏组织中分离得到单个核细胞，采用流式细胞术检测各细胞亚群的比例。CD3、CD4、CD8染色检测小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例；CD44、CD62L染色，检测效应CD4+T细胞和CD8+T细胞比例；Ki67染色，检测CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。CD4、CD25、Foxp3、染色检测小鼠Tregs比例，GzmA、GzmB、Prf染色检测小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌CTL多效应因子的水平。收集小鼠的血清和新鲜肿瘤组织，采用ELISA检测小鼠血清和肿瘤组织中，IFN-γ的水平。采用流式分选的方法获取WT小鼠和dnTGF-βRⅡ转基因小鼠脾脏原代CD3+T细胞，提取RNA，采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测GzmA、GzmB、Prf、IFN-γ的转录水平。同样的方法提取小鼠肿瘤组织中的RNA，采用QPCR检测小鼠肿瘤组织中GzmA、GzmB、Prf、IFN-γ的转录水平。 dnTGF-βRⅡ对T细胞体外抗肿瘤效应的影响与机制探究：为了验证dnTGF-βRⅡ对T细胞体外抗肿瘤效应的影响，我们在体外将不同来源的T细胞与肿瘤细胞进行共培养。由于LLC细胞的抱团生长特性，不利于共培养结束后的后续实验进行，因此我们选择MCA205与T细胞进行共培养实验。采用流式分选的方法获取WT小鼠和dnTGF-βRⅡ转基因小鼠脾脏原代的CD3+T细胞，采用ConA刺激6小时后（另设空白对照组），与1×105（12孔板）或者5×105（6孔板）处于对数生长期的MCA205细胞直接接触共培养48小时。共培养结束后，采用高内涵成像系统检测MCA205的增殖水平，采用AnnexinV-PI染色，并使用流式细胞术进行检测MCA205细胞的凋亡水平。采用流式分选的方法获取WT小鼠和dnTGF-βRⅡ转基因小鼠脾脏原代的CD3+T细胞，提取RNA，采用QPCR检测T-bet的转录水平。同样的方法提取小鼠肿瘤组织中的RNA，采用QPCR检测小鼠肿瘤组织中T-bet的转录水平。 结果： 1、小鼠皮下荷瘤模型的建立与肿瘤负荷评估 1.1小鼠体重、肿瘤组织体积及重量 在注射LLC细胞的肺癌模型中，WT组小鼠与dnTGF-βRⅡ组小鼠体重差异无显著性，且与WT小鼠相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠的肿瘤体积小，肿瘤的生长速度慢。此外，与WT小鼠相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠的肿瘤重量小。在注射MCA205细胞的纤维肉瘤模型中，观测到相似的结果。 1.2小鼠肿瘤组织病理 在注射LLC细胞的肺癌模型中，HE染色表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠的肿瘤组织呈现出细胞收缩、稀疏排列和破碎，且肿瘤组内显现出广泛的坏死。在注射MCA205细胞的纤维肉瘤模型中，观测到相似的结果。 1.3小鼠肿瘤组织中细胞凋亡和增殖情况 在注射LLC的肺癌模型中，TUNEL染色和Caspase-3免疫组化表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠的肿瘤组织中细胞凋亡多。此外，Ki67染色表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠肿瘤组织中细胞增殖水平低。在注射MCA205细胞的纤维肉瘤模型中，观测到相似的结果。 2、小鼠抗肿瘤免疫的检测与评估 2.1dnTGF-βRⅡ对小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖的影响 在注射LLC的肺癌模型中，流式分析结果表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠肿瘤组织及脾脏组织中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例高，此外，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠肿瘤组织及脾脏组织中Ki67+CD4+和Ki67+CD8+T细胞的比例高，表明dnTGF-βRⅡ组CD4+T细胞核CD8+T细胞的增殖多。在注射MCA205细胞的纤维肉瘤模型中，观测到相似的结果。 2.2dnTGF-βRⅡ对小鼠效应CD4+T细胞和CD8+T细胞的影响 在注射LLC的肺癌模型中，流式分析结果表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠肿瘤组织及脾脏组织中效应CD4+T细胞（CD44+CD62L－CD4+）和效应CD8+T细胞（CD44+CD62L－CD8+）的比例高。在注射MCA205细胞的纤维肉瘤模型中，观测到相似的结果。 2.3dnTGF-βRⅡ对小鼠Tregs及CTL功能的影响 在注射LLC的肺癌模型中，流式分析的结果表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠肿瘤组织及脾脏组织中Tregs的比例低，但是CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌CTL多效应因子的水平增加。QPCR结果表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠肿瘤组织及脾脏T细胞中合成CTL多效应因子的mRNA水平高。此外，ELISA结果表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠血清及肿瘤组织中IFN-γ的水平高。在注射MCA205细胞的纤维肉瘤模型中，观测到相似的结果。 3、dnTGF-βRⅡ对T细胞体外抗肿瘤效应的影响与机制探究 3.1dnTGF-βRⅡ对T细胞体外抑制肿瘤细胞增殖的影响 T细胞与MCA205细胞体外共培养，高内涵成像结果表明，无论是否使用了ConA预处理T细胞，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组的MCA205细胞总的细胞数目少，增殖受到的抑制显著。 3.2dnTGF-βRⅡ对T细胞体外诱导肿瘤细胞凋亡的影响 T细胞与MCA205细胞体外共培养，流式细胞术分析AnnexinV-PI染色，结果表明，使用ConA预处理T细胞6小时后，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组的MCA205细胞总的凋亡比例高。 3.3dnTGF-βRⅡ对T-bet的影响 QPCR结果表明，与WT组相比，dnTGF-βRⅡ组小鼠肿瘤组织及脾脏来源的T细胞中T-bet的mRNA水平升高，且在T细胞中T-bet的水平升高更加显著。 结论： 1、dnTGF-βRⅡ降低小鼠的肿瘤负荷，促进肿瘤组织坏死，降低肿瘤组织中KI67表达，升高肿瘤组织中TUNEL+细胞比例和Caspase-3的表达； 2、dnTGF-βRⅡ促进T细胞体外对肿瘤细胞的杀伤，升高小鼠肿瘤组织和脾脏中CD4+、CD8+、KI67+CD4+、KI67+CD8+以及CD44+CD62L－CD4+、CD44+CD62L－CD8+T细胞比例，促进CTL多效应因子的表达，降低小鼠脾脏和肿瘤组织中Tregs比例，增强抗肿瘤免疫； 3、dnTGF-βRⅡ所引起的CTL多效应分子的分泌增多，可能与促进T-bet的表达相关。
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