摘要
研究背景： 临床证据表明，手术后20%的患者会出现创伤后应激综合症（Post-traumaticstresssyndrome,PTSD），但目前并不清楚手术后PTSD发生的具体原因与机制。大脑是处理疼痛和记忆共同的中枢，研究表明疼痛与认知存在偶联的神经环路或分子机制，它们之间可能会相互影响，从而导致疼痛后认知的变化。另外，已有研究显示术后急性疼痛是PTSD的独立危险因素。因此，手术后的急性疼痛是否通过增强术前不良记忆并导致术后PTSD的发生？如果上述猜想正确，那么急性疼痛导致记忆增强的神经环路或分子机制是什么？阐明这些问题对于解释或预防术后PTSD的发生具有重要意义，值得我们进行思考。 众所周知，PTSD的发生与记忆巩固增强密切相关。记忆巩固是短期记忆向长期记忆稳定化的过程，依赖于神经元活性与突触可塑性的变化。手术切口痛，作为一种术后常见的急性疼痛，其对术前不良事件记忆巩固的影响很大程度上是未知的。并且术前患者常经历过创伤事件或具有一些不愉快的治疗体验，而手术导致的疼痛又往往发生在这些事件或不愉快治疗体验的记忆巩固阶段，因此探究术后急性疼痛对记忆巩固的影响可能有助于解释术后急性疼痛诱发PTSD的原因。 蓝斑核(Locuscoeruleus,LC)位于脑桥背侧，是中枢神经系统中去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)和多巴胺（Dopamine,DA）的主要来源，主要参与唤醒、记忆、认知、疼痛等多种生理功能的调节。最近的研究表明，蓝斑核投射到海马的TH+（酪氨酸羟化酶，Tyrosinehydroxylase）神经元释放的去甲肾上腺素和多巴胺是依赖于海马记忆形成的关键递质。行为研究已经证实，海马多巴胺受体1和5（D1/D5）以及β-肾上腺素受体的激活不仅有助于记忆编码，而且对于将短期记忆转化为依赖蛋白质合成的长期记忆也是必要的。另外，β-肾上腺素受体以及D1/D5受体的激活对于维持海马CA1的长时程增强（Long-termpotentiation,LTP）同样不可或缺。研究已经证实，急性应激增加蓝斑核神经元活性。因而，手术切口痛作为术后一种常见的应激刺激，有可能会激活蓝斑核-海马TH+投射，并在海马释放去甲肾上腺素与多巴胺增强记忆巩固。基于以上背景，本研究旨在观察手术切口痛对小鼠记忆巩固的影响，并探讨蓝斑核-海马TH+投射的活性变化在手术切口痛后记忆巩固增强中的作用。 研究目的: 1.探究手术切口痛对情绪记忆与非情绪记忆记忆巩固的影响。 2.探究蓝斑核-海马的TH+投射在手术切口痛对情绪记忆与非情绪记忆巩固影响中的作用。 3.探究蓝斑核-海马的TH+投射激活后释放的去甲肾上腺素与多巴胺在手术切口痛对情绪记忆与非情绪记忆巩固影响中的作用。 研究方法: 1.手术切口痛对情绪记忆与非情绪记忆记忆巩固的影响 1.1通过被动逃避与新物体识别训练使C57BL/6小鼠获得一定的情绪记忆与非情绪记忆后，观察手术切口痛对小鼠情绪记忆与非情绪记忆记忆巩固的影响。 1.2采用旷场实验观察手术切口痛后24小时小鼠的运动能力以及焦虑状况，排除手术切口痛通过影响小鼠的自主运动或焦虑状态来提高记忆巩固。 1.3被动逃避与新物体识别的获得性训练6小时（记忆巩固窗口期）后行手术切口痛造模，并观察造模后18小时小鼠的记忆保留情况，排除手术切口痛是通过增强记忆提取而不是增加记忆巩固导致记忆保留的增强。 2.蓝斑核-海马TH+投射在手术切口痛对情绪记忆与非情绪记忆巩固影响中的作用 2.1TH-Cre小鼠上使用病毒示踪技术验证蓝斑核到海马存在TH+投射。 2.2免疫荧光观察手术切口痛对蓝斑核TH+神经元c-Fos表达的影响；海马CA1区注射基于Cre重组酶表达的逆行非跨突触病毒后，膜片钳记录手术切口痛后4小时蓝斑核投射到海马的TH+神经元放电频率的变化。 2.3对照小鼠与手术切口痛小鼠的蓝斑核分别注射化学遗传病毒rAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry与rAAV-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry，海马CA1区注射氯氮平N-氧化物（Clozapine-N-oxide，CNO）正反调控蓝斑投射到海马的TH+神经元活性,观察激活与抑制蓝斑核-海马的TH+投射对小鼠记忆巩固的影响。最后，在手术切口痛模型小鼠的海马CA1分别微量注射去甲肾上腺素受体阻滞剂普萘洛尔（3.125μg/0.5μl/side）与多巴胺受体1/5受体（D1/5）阻滞剂SCH23390（0.5μg/0.5μl/side），明确蓝斑核-海马的TH+投射释放的何种递质介导了手术切口痛后记忆巩固的增强作用。 研究结果: 1.手术切口痛增强小鼠的情绪记忆与非情绪记忆记忆巩固 手术切口痛后24小时小鼠的被动逃避潜伏期中位数为392.5S（四分位间距：255.5-600S），而对照组小鼠被动逃避潜伏期的中位数为187.0S（四分位间距：142.8-600S）；在新物体识别实验中，训练后24小时对照组小鼠的新物体偏好指数为20.5±8.1%，而手术切口痛组小鼠的新物体偏好指数为36.1±12.7%。与对照组相比，手术切口痛显著增加小鼠的被动逃避潜伏期与新物体识别偏好指数（P＜0.05，n=14）。并且，手术切口痛对小鼠的记忆提取、自主运动以及焦虑状态均无明显影响（P＞0.05，n=14） 2.蓝斑核-海马TH+投射的激活介导手术切口痛后情绪记忆与非情绪记忆记忆巩固增强 手术切口痛小鼠注射化学遗传病毒（rAAV-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry）抑制蓝斑核-海马的TH+投射后，小鼠被动逃避实验中的记忆潜伏期中位数为218.0S（四分位间距：177.5-345.0S），新物体偏好指数为26.8±9.8%；相较而言，手术切口痛小鼠的被动逃避潜伏期中位数410.0S（四分位间距：282.5-600S），新物体识别物体偏好指数40.6±13.5%。与手术切口痛小鼠相比，注射化学遗传抑制病毒小鼠的被动逃避记忆潜伏期与新物体偏好指数显著降低（P＜0.05，n=14）。 类似的，使用rAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry病毒激活蓝斑核-海马TH+投射后，小鼠的被动逃避潜伏期的中位数为448.5S（四分位间距：315.5-600S），新物体识别指数为36.3±10.1%。注射空病毒的对照组小鼠的被动逃避潜伏期中位数196.5S（四分位间距：120.8-581S），新物体识别指数22.5±6.7%。与对照组相比,rAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry激活蓝斑核-海马的TH+投射显著增强小鼠的记忆巩固（P＜0.05，n=14）。另外，手术切口痛小鼠注射rAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry病毒组的被动逃避潜伏期中位数414.5S（四分位间距：272.5-600.0S），新物体识别指数37.2±7.6%；而注射空病毒的手术切口痛组小鼠的被动逃避潜伏期中位数465.0S（四分位间距：284.3-600S），新物体识别指数33.9±10.9%。与手术切口痛组小鼠相比，注射rAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry病毒激活蓝斑核-海马TH+投射并不增强手术切口痛后的记忆巩固（P＞0.05，n=14）。 3．海马CA1多巴胺受体激活介导手术切口痛后情绪记忆与非情绪记忆记忆巩固增强 被动逃避训练与新物体识别训练后即刻双侧海马CA1区微量注射D1/5受体拮抗剂SCH23390（0.5μg/0.5μl/side）显著降低手术切口痛小鼠的被动逃避潜伏期与新物体识别偏好指数（P＜0.05，与手术切口痛组比较，n=14）。但海马CA1区注射β-肾上腺素能受体阻滞剂普萘洛尔（3.125μg/0.5μl/side）对手术切口痛小鼠的被动逃避潜伏期与新物体识别偏好指数无明显影响（P＞0.05，n=14）。 研究结论： 手术切口痛增强小鼠的情绪记忆与非情绪记忆记忆巩固，疼痛激活蓝斑核-海马TH+投射后释放的多巴胺可能是手术切口痛后记忆巩固增强的机制之一。
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