摘要
目的：观察金钗石斛碱（dendrobine,Dendr）抗过氧化氢诱导的人角质形成细胞氧化损伤的作用，并通过Nrf2/Keap1信号通路探讨其作用机制，旨在为将金钗石斛开发成为一种具有抗氧化功能的产品提供实验依据。 方法：体外培养人源性角质形成细胞株（keratinocyte,HACAT），首先对石斛碱和H2O2的浓度进行筛选，分组①：石斛碱（0，0.01，0.1，1，10，100μM）；分组②：H2O2（0，100，200，400，800μM）；分别给予相应浓度的石斛碱和H2O2作用24h后，通过MTT法检测细胞活力，确定后续实验中石斛碱和H2O2的浓度。继而观察石斛碱对H2O2诱导的细胞毒性作用；分组③：空白对照组，空白+石斛碱1μM组，H2O2组，H2O2+石斛碱0.01μM组，H2O2+石斛碱0.1μM组，H2O2+石斛碱1μM组，H2O2+阳性药维生素E50μM组；预先给予石斛碱作用12h，再给予H2O2处理24h，处理结束后分别采用MTT法和LDH试剂盒检测细胞活力及LDH漏出率；通过光学显微镜观察HACAT细胞形态的改变。进一步检测石斛碱对H2O2诱导的细胞氧化应激及凋亡水平的影响。分组同③，活性氧（ROS）荧光定量试剂盒检测细胞中ROS水平；酶活性试剂盒检测细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）的活性及丙二醇（MDA）含量；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）以及Westernblot检测CAT和GSH-Px的mRNA水平及蛋白表达情况。TUNEL法检测细胞凋亡水平；Westernblot检测Bax、Bcl-2、细胞色素C（cytoC）的蛋白表达及cleaved-Caspase9和cleaved-Caspase3的蛋白水平。最后通过Nrf2/Keap1信号通路探讨石斛碱的作用机制，观察Nrf2/Keap1信号通路关键分子的变化情况。分组同③，免疫荧光染色和Westernblot检测核因子E2相关因子2（Nrf2）的细胞核转位情况；Westernblot及RT-qPCR检测Nrf2、Keap1、血红素加氧酶1（HO-1）、醌氧化还原酶1（NQO1）蛋白的表达和mRNA水平。再沉默Nrf2探讨石斛碱的作用，分组④：si-Control组、si-Control+H2O2组、si-Control+H2O2+石斛碱组、si-Nrf2+H2O2组、si-Nrf2+H2O2+石斛碱组；转染Nrf2-siRNA24h后，给予石斛碱作用12h，再孵育H2O224h，处理结束后MTT法检测细胞活力；LDH试剂盒检测LDH漏出率；Westernblot检测Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1、SOD2、CAT、Bax及Bcl-2蛋白表达的影响。 结果：浓度筛选结果表明石斛碱的浓度不超过1μM时没有影响细胞活力；H2O2浓度为400μM时，细胞活力降低至65%左右；因此，后续实验选择0.01，0.1及1μM的石斛碱和400μM的H2O2。石斛碱对H2O2诱导细胞毒性作用的结果显示：H2O2导致细胞活力下降、LDH升高，细胞变圆、体积变小、排列稀疏且紊乱；不同浓度石斛碱预处理后提高了细胞活力、降低了LDH漏出率，并使细胞体积和形状均接近正常细胞。细胞氧化应激及凋亡的结果显示：H2O2引起HACAT细胞中ROS和MDA含量增加，经石斛碱预处理后ROS和MDA含量显著减少；H2O2降低了SOD、CAT及GSH-Px的活性，石斛碱则明显抑制了抗氧化酶活性水平的下降。H2O2导致HACAT的细胞凋亡，石斛碱预处理之后抑制了细胞凋亡，调节了凋亡相关蛋白的表达，包括降低了Bax、cytoC的蛋白表达和cleaved-Caspase9及cleaved-Caspase3的蛋白水平，提高了Bcl-2的蛋白表达。通过Nrf2/Keap1信号通路探讨石斛碱作用的结果显示：在H2O2的刺激下石斛碱促进Nrf2向核内转位；还降低Keap1蛋白及mRNA的表达，升高HO-1和NQO1蛋白表达及mRNA的水平。Nrf2基因的沉默效率显示转染浓度为60nM时，Nrf2蛋白表达水平减低了约70%，因此后续实验采用60nM作为沉默Nrf2的浓度。Nrf2沉默之后，再给H2O2处理，细胞活力下降更为明显，给予石斛碱后细胞活力下降的状态也未改善；并且石斛碱对Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1、SOD2、CAT、Bax及Bcl-2蛋白的调节作用也受到了抑制。 结论：金钗石斛碱抑制H2O2诱导的HACAT细胞毒性，降低氧化应激及细胞凋亡水平，其作用机制与石斛碱激活Nrf2/Keap1信号通路及调节抗氧化酶活性相关。
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