摘要
微生物代谢工程旨在利用微生物作为宿主最大限度地生产有价值的化合物。为生物燃料、药品、天然产物等化学品提供了有效的替代合成途径。达到目标化学品理想的产量和转化率需要对生物合成途径进行复杂的优化和改造。在代谢工程中开发并使用生物传感器对代谢途径进行检测、筛选或动态调控，以达到通路的最佳状态已经成为近年来的研究热点。血红素是一种典型的四吡咯化合物，可以作为调味剂用于肉制品合成，同时，血红素也是卟啉病治疗中的关键药物。其生物合成途径涉及到多种有价值的化学品，例如5-氨基乙酰丙酸(ALA)、西罗血红素和叶绿素等。血红素参与包括呼吸、细胞分化、信号转导、昼夜节律和气体感应在内的多种生理生化反应，是细胞维持正常生理功能所必需的物质。然而，过量的游离血红素对细胞是有毒的。血红素的必要性和毒性增加了改造血红素生物合成途径的难度，增强或降低目标基因的表达量可能会对血红素的生物合成造成负面影响。在关于血红素生物合成途径的研究中，由于血红素自身复杂的调控机制，传统的代谢工程策略取得的成效十分有限。因此，开发并利用响应血红素的生物传感器对于血红素生物合成途径的调控及优化具有重要意义。本论文开发了来源于乳酸乳球菌（lactococcuslactis）的血红素生物传感器HrtR，并利用HrtR在大肠杆菌（Escherichiacoli中构建了血红素响应的动态调控系统及生长偶联的高通量筛选工具。分别实现了保持血红素稳态下的化学品高效生产和血红素生物合成途径最佳基因表达量组合的筛选。 1.血红素响应动态调控系统的构建与应用 本论文首先在大肠杆菌中以编码绿色荧光蛋白的gfp作为报告基因对血红素生物传感器HrtR进行表征。由于大肠杆菌DH5α不含有血红素内运系统，无法直接通过外源添加血红素进行剂量响应曲线的测定。我们在DH5α菌株中过表达了多种血红素内运蛋白，最终确定来源于大肠杆菌O157∶H7EDL933(E.coliO157∶H7EDL933）的转运蛋白ChuA可以赋予DH5α内运血红素的能力。同时利用血红素生产能力不同的菌株进一步证实了报告基因gfp表达量与胞内血红素浓度的线性关系。为了精细调节HrtR对血红素的亲和力，我们根据HrtR与血红素的结合构象挑选了HrtR中与血红素结合相关的3个氨基酸进行饱和突变，分别为Val131，His149和Thr68。利用GFP的荧光强度表示突变体与血红素的亲和力高低，从57种突变体中挑选5种突变体(H149S、V131L、T68L、V131I、H149D)进行剂量响应曲线的测定。经过外源添加血红素确定了突变体H149S、T68L和V131L的剂量响应曲线并计算出其血红素亲和力和半最大效应物浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，EC50)，但外源添加的血红素无法完全将突变体V131I和H149D解离。为此，我们使用分子动力学模拟和体外滴定的方法对V131I和H149D的血红素亲和力进行预测和测定，并最终成功地测定了五种突变体的血红素亲和力。 利用已表征的HrtR和基因沉默工具CRISPRi设计了响应血红素的动态调控系统。该系统以HrtR作为感应器检测胞内游离血红素的浓度变化并将信号传递至CRISPRi，CRISPRi作为效应器精准抑制靶基因。靶基因的抑制会造成血红素生物合成的减少，当血红素浓度较低时，HrtR抑制CRISPRi的表达从而解除靶基因的抑制，恢复血红素的生物合成。首先使动态调控系统作用于ALA脱水酶（ALAD，由hemB编码），同时也作用于红色荧光蛋白mKate2以表征动态调控系统的调控效果。通过对CRISPRi抑制强度的优化，可以观察到mKate2荧光强度的变化但无法观测到红色荧光的动态波动。于是我们优化了mKate2的启动子和RBS强度，成功观察到了红色荧光的动态波动。利用实时定量PCR测定das9和hemB的表达强度，成功的在转录水平证明了动态调控系统的功能。 最后，将动态调控系统应用于ALA的生产中，当其作用于hemB时，可以将ALA产量由2.4g/L提高至3.75g/L。通过测定发酵过程中的胞内血红素浓度，可以发现在发酵的不同时间内，胞内血红素浓度不断波动，该结果证实了动态调控系统可以在生产中保持血红素的稳态并提高目标化学品产量。将野生型HrtR更换为不同突变体，可以观测到ALA的产量发生了变化，其中突变体H149D将ALA产量提高至5.35g/L，进一步表明了生物传感器配体亲和力的精确调节对于目标化学品的生产是有利的。动态调控系统在胆色素原(PBG)和卟啉的生产中也取得了较好的效果，使用精确调节的生物传感器使PBG和总卟啉的产量分别提高了55.7％和41％。 2.生长偶联的高通量筛选工具的构建及应用 本论文利用HrtR同时构建了基于生长偶联的高通量筛选工具。不同于基于流式荧光细胞分选(FACS)的高通量筛选工具，我们没有选取gfp和rfp等编码荧光蛋白的基因作为高通量筛选的报告基因，这是因为血红素及其生物合成的中间体会对荧光蛋白的测定造成影响。我们使用HrtR调控四环素抗性基因tcR，高水平的胞内游离血红素会使得菌株抵抗四环素(Tetracyclines)的能力增强从而获得更好的生长状态，利用生长状态的差异可以在连续迭代中富集出生产血红素能力更强的菌株。在含有四环素的LB培养基中添加一定浓度的ALA或血红素，将含有筛选质粒的菌株在该培养基中培养12h并测定OD600。结果表明ALA或血红素的添加可以改善菌株在四环素下的生长状态。通过梯度添加0-250μg/mL的四环素，确定了用于筛选的最适浓度为140μg/mL，在该浓度下，添加ALA或血红素的菌株与对照组呈现出最明显的生长差异。 我们使用以上构建的高通量筛选工具筛选高产原卟啉IX(PPIX)的菌株。PPIX是血红素的前体，由ALA合成PPIX需要hemB/C/D/E/F/Y的共同催化，分别使用4种不同强度的RBS调控每一个基因，组合后得到了途径基因不同表达强度的文库。将文库转入含有筛选质粒的菌株中，在四环素浓度为140μg/mL的LB培养基中连续传代培养。经过四次传代，富集出高产PPIX的菌株，PPIX产量达到了160.78mg/L。将富集到的菌株进行测序，在高产菌株中，hemD和hemY的表达量低于hemB、hemC、hemE和hemF的表达量。这证明了相较于高水平表达途径基因，合理的通量平衡可以取得更好的效果。在高水平生产PPIX的菌株基础上过表达来源于枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的亚铁离子螯合酶(FECH，由hemH编码)，菌株有了一定生产血红素的能力。优化hemH的起始密码子且过表达血红素外运蛋白使血红素的产量进一步增加。经过发酵条件的优化，最终胞外血红素产量达到了8.34mg/L。这证明生长偶联的高通量筛选工具可以成功用于血红素生物合成途径的代谢优化，同时证明了代谢通量平衡对于血红素的合成有着重要意义。 综上所述，本论文基于血红素生物传感器构建了动态调控系统和高通量筛选系统，分别解决了血红素合成途径代谢工程中的不同问题，进一步增强了大肠杆菌生产血红素及血红素合成途径相关化学品的能力。
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