摘要
背景： 骨水泥广泛应用于全膝/全髋关节置换术、经皮椎体成形术，以及骨肿瘤、骨髓炎和创伤等导致的骨缺损。1946年，法国的Robert Judet首次将聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate，PMMA)骨水泥应用于骨科，目前使用的主流骨水泥亦是PMMA骨水泥。但是，PMMA骨水泥具有生物惰性、不可生物降解性、潜在的细胞毒性、高聚合温度以及力学强度过大等缺点，因此，骨水泥-宿主骨界面无法形成有效的骨整合，骨水泥-宿主骨界面的固定完全依靠骨水泥和宿主骨之间的机械交锁作用，不可避免地或早或晚会发生骨水泥-宿主骨界面的无菌性松动。据统计，75％的关节假体失效是由于骨水泥-宿主骨界面发生了无菌性松动。已有大量的研究旨在改善PMMA骨水泥的上述缺点，如在PMMA骨水泥中添加羟基磷灰石、掺锶羟基磷灰石、壳聚糖和透明质酸等，但均发现，经过改性后的PMMA骨水泥力学强度大幅下降，且对PMMA骨水泥的生物活性提升不足。因此，须研发一种生物活性材料，用于PMMA骨水泥改性，在骨水泥力学强度要求的范围内，增加骨水泥的成骨能力，且不降低或增加骨水泥的生物相容性。 方法： 生物活性骨水泥体系的设计:首先合成纳米级层状镁铝氢氧化物，通过原位自生长技术，生成微米级镁铝氢氧化物。购买商用PMMA骨水泥，将层状镁铝氢氧化物和PMMA骨水泥粉剂充分混匀后，按比例加入PMMA液体引发剂，固化形成生物活性骨水泥。 （一）层状镁铝氢氧化物（镁铝水滑石）的合成 称取一定量的Mg(NO3)2·6H2O、尿素和Al(NO3)3·9H2O，将其溶解在70mL的去离子水中。充分溶解后，将混合溶液转移到100mL的聚四氟乙烯衬里，随后放入高压反应釜中在100℃下加热24小时。使用去离子水，将收集到的胶体沉淀使用4，000rpm转速离心洗涤三次，然后在60℃下在空气中干燥得到的白色胶体，干燥后得到的固体样品研磨成白色粉末即为镁铝水滑石（MgAl-layered double hydroxide，MgAl-LDH）。X射线衍射仪（X-ray diffraction，XRD）检测MgAl-LDH的组成成分，扫描电子显微镜（Scanning electron microscope，SEM）检测MgAl-LDH的表面形貌学及材料粒径。 （二）骨水泥和改性骨水泥的制备 使用MgAl-LDH、COL-Ⅰ、MgAl-LDH&COL-Ⅰ改性PMMA骨水泥，具体见表0-1。将各组的粉末充分混匀后，加入液态引发剂，充分搅拌1min后静置。待骨水泥进入面团期后，使用预制模具制备直径6mm&厚度2.5mm的圆盘状细胞和动物实验测试样本，以及直径6mm&高度12mm的圆柱状、长度75mm&宽度10mm&厚度3.3mm的片状力学测试样本。 （三）骨水泥和改性骨水泥的理化性能检测 使用红外线成像仪监测纯骨水泥和改性骨水泥在聚合反应过程中的温度变化。使用扫描电子显微镜观察纯骨水泥和改性骨水泥的表面形貌学。使用能谱仪(Energy dispersive spectrometer，EDS)检测纯骨水泥和改性骨水泥表面的元素组成及其分布。使用原子力显微镜(Atomic force microscope，AFM)定量纯骨水泥和改性骨水泥的表面粗糙度。体外离子缓释实验检测PMMA&LDH和PMMA&COL-Ⅰ&LDH的镁离子释放曲线，以及PMMA&COL-Ⅰ和PMMA&COL-Ⅰ&LDH的钙离子释放曲线。使用万能材料试验机测试纯骨水泥和改性骨水泥的抗弯强度、抗压强度、抗弯模量以及抗压模量。 （四）骨水泥和改性骨水泥的体外成骨和生物相容性检测 使用纯骨水泥和改性骨水泥的浸提液培养入骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cells，HBMSCs)，同时将一定量的人骨髓间充质干细胞直接接种在骨水泥和改性骨水泥表面。使用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8，CCK-8)和流式细胞术测试接种在骨水泥和改性骨水泥表面HBMSCs的细胞增殖和凋亡情况。通过碱性磷酸酶和茜素红S染色半定量分析改性骨水泥促进HBMSCs成骨分化的情况。通过转录组测序和通路(Ingenuity Pathway Analysis，IPA)分析揭示PMMA&LDH促进HBMSCs细胞成骨分化的关键信号通路，并通过实时定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time polymerase chain reaction，qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot，WB)验证上述信号通路。 （五）骨水泥和改性骨水泥的体内成骨和生物相容性检测 动物水平，前期基于新西兰大白兔，成功构建了颅骨缺损模型，用于测试骨水泥和改性骨水泥的体内成骨性能，术后即刻和术后1个月，通过腹腔序贯注射茜素红S和钙黄绿素溶液。分别在术后1个月和术后2个月取材完整颅骨、心脏、肝脏、脾脏、肾脏和脊髓。使用微计算机断层扫描技术(Micro computed tomography，micro-CT)量化骨再生情况，硬组织切片后通过激光共聚焦扫描电子显微镜(Laser confocal scanning electron microscope，LC SEM)、亚甲基蓝-酸性品红染色观察骨组织的再生情况;通过苏木素-伊红染色观察脏器微观结构的改变。 结果： （一）层状镁铝氢氧化物（镁铝水滑石）的合成 通过温和的一步化学合成法和原位自生长技术，XRD结果表明成功合成了镁铝水滑石（发明专利号:ZL201910162303.6，专利已授权）。SEM结果显示合成的镁铝水滑石为微米级，粒径为6±2μm。 （二）骨水泥和改性骨水泥的制备 将一定质量比的MgAl-LDH粉末和或COL-Ⅰ粉末引入到PMMA骨水泥粉末中，根据PMMA骨水泥使用手册，将骨水泥粉末和液体引发剂混合，使用预制模具制备相应尺寸的骨水泥和改性骨水泥待测样本。 （三）骨水泥和改性骨水泥的理化性能检测 PMMA骨水泥、PMMA&COL-Ⅰ骨水泥、PMMA&LDH骨水泥、PMMA&COL-Ⅰ&LDH骨水泥的最高聚合温度分别为95.2℃、100℃、88.2℃、99.7℃，且表面粗糙度逐渐增加。改性骨水泥的工作时间未见显著缩短。除PMMA&COL-Ⅰ&LDH骨水泥的抗弯强度外，其他改性骨水泥的力学强度均符合ISO5833-2002标准。PMMA&LDH和PMMA&COL-Ⅰ&LDH骨水泥缓释的镁离子缓释分别维持在～1.6μmol/mL和～1.3μmol/mL。PMMA&COL-Ⅰ和PMMA&COL-Ⅰ&LDH骨水泥的钙离子缓释浓度分别维持在约0.30μmol/mL和0.20μmol/mL。 （四）骨水泥和改性骨水泥的体外成骨和生物相容性检测 改性骨水泥的生物相容性优于纯骨水泥，且PMMA&LDH和PMMA&COL-Ⅰ&LDH骨水泥可在体外通过p38MAPK、ERK/MAPK、FGF18和TGF-β信号通路显著促进细胞成骨分化。 （五）骨水泥和改性骨水泥的体内成骨和生物相容性检测 Micro-CT发现PMMA&LDH、PMMA&COL-Ⅰ&LDH和PMMA&COL-Ⅰ组术后2个月的体内骨再生量分别是PMMA骨水泥组的9.26倍、9.12倍和5.02倍，激光共聚焦扫描电子显微镜和酸性品红染色的结果与micro-CT相符合。动物心脏、肝脏、肾脏、脾脏、脊髓的微观结构未见显著改变。 结论： 与纯PMMA骨水泥比较，PMMA&LDH骨水泥的力学强度有轻度下降、最高聚合温度显著下降，这有利于缓解应力遮挡性骨溶解和减少骨水泥聚合反应产生的高温所导致的骨水泥周围细胞坏死和组织纤维化，一定程度上加速骨整合。在体内外，PMMA&LDH骨水泥的成骨能力和生物相容性良好。因此，PMMA&LDH骨水泥是一种具有潜在应用潜力的生物活性骨水泥。
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