摘要
本文从以下两部分进行阐述： 第一部分血浆IgA1铰链区O-糖基化修饰缺失作为IgA肾病诊断标志物的研究 背景：IgA1铰链区O-糖基化异常在IgA肾病(IgA nephropathy，IgAN)发病机制中发挥重要作用。既往蛋白质组学研究发现IgAN患者循环IgA1铰链区O-糖修饰中N-乙酰半乳糖胺(N-acetylgalactosamine，GalNAc)和半乳糖(galactose，Gal)数目显著低于健康人。然而IgAN患者循环IgA1铰链区O-糖型特征对于IgAN的诊断效能尚不清楚。本部分研究目的是利用液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技术解析IgAN、非IgA其他肾小球疾病对照患者(disease control，DC)和健康对照(healthy control，HC)三组间血浆IgA1铰链区O-糖型差异，并进一步评估循环IgA1铰链区O-糖基化特征的诊断效能。 方法：纳入北京协和医院肾内科住院肾活检明确诊断的原发性IgAN患者62例、其他肾小球疾病30例(10例膜性肾病、10例局灶节段性肾小球硬化和10例微小病变肾病)及30例健康对照。留取上述患者和健康对照血浆分别用KM55试剂盒检测Gd-IgA1水平，同时IgA免疫亲和珠从血浆中提取IgA，经过去N糖、还原烷基化、胰蛋白酶切及去唾液酸化处理，亲水色谱法(hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC)富集IgA1铰链区完整O-糖肽。液相色谱串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)检测IgA1铰链区O-糖型，用Byonic软件及手工解析血浆IgA1铰链区O-糖型特征。比较三组间血浆IgA1铰链区O-糖型及糖基化特征差异，分析IgAN患者血浆IgA1铰链区O-糖基化修饰特征与临床及病理指标相关性，评估血浆IgA1铰链区O-糖基化特征GalNAc和Gal数目对IgAN的诊断效能。 结果：①122例患者中共鉴定到48种IgA1铰链区完整O-糖肽，IgAN患者血浆IgA1铰链区O-糖型与DC和HC组患者显著不同。 ②三组中血浆IgA1铰链区12种主要糖型对应的O糖肽所占比例见表1.2。其中，IgAN组和DC相比，GalNAc3Gal3所占比例显著增高(p＜0.05)，而GalNAc5Gal4和GalNAc6Gal5所占比例显著降低(p＜0.05)。IgAN组和HC相比，GalNAc3Gal3和GalNAc4Gal2所占比例显著升高(p＜0.05），而GalNAc5Gal5和GalNAc6Gal4所占比例显著降低(p＜0.05）。 ③IgAN患者血浆IgA1铰链区GalNAc数目明显少于DC(IgAN vs DC：4.358±0.104vs4.471±0.073,p＜0.001)和HC(IgAN vs HC：4.358±0.104vs4.488±0.135,p＜0.001);IgA1铰链区Gal数目显著低于DC(IgAN vs DC：3.591±0.126vs3.733±0.147)和HC(IgAN vs HC：3.591±0.126vs3.712±0.134,p＜0.001)。 ④IgA1铰链区Gal数目与血浆Gd-IgA1水平呈负相关(r=-0.283,p=0.026)，IgA1铰链区Gal数目与血浆C3水平呈正相关(r=0.335,p=0.008)。 ⑤以DC和HC为对照，血浆Gd-IgA1诊断IgAN的AUC分别是0.703(95％CI：0.591,0.815)和0.683(95％CI：0.565-0.802)。以DC和HC为对照，血浆IgA1铰链区Gal、GalNAc数目和GalNAc-Gal panel诊断IgAN的AUC显著高于Gd-IgA1水平诊断IgAN的AUC(IgAN vs DC：Gal,GalNAc,GalNAc-Gal panel：0.793vs.0.805vs.0.852;IgAN vs HC：Gal,GalNAc,GalNAc-Gal panel：0.764vs.0.809vs.0.844)。将血IgA水平加入GalNAc-Gal panel,以DC和HC为对照，GalNAc-Gal-IgA panel诊断IgAN的AUC分别是0.911(95％CI：0.854-0.967)和0.927(95％CI：0.866-0.988)。 结论：①与健康对照和其他肾小球疾病相比，IgAN患者血浆IgA1铰链区GalNAc和Gal数目显著少于其他肾小球疾病(MN、MCD及FSGS)及健康人。 ②IgAN患者血IgA1铰链区Gal数目与血Gd-IgA1及补体C3水平显著相关。 ③血IgA1铰链区GalNAc、Gal数目联合血IgA水平（GalNAc-Gal-IgA panel）用于IgAN的诊断效能，显著优于GalNAc-Gal panel、GalNAc、Gal数目和血Gd-IgA1水平，对IgAN具有良好的诊断效能。 第二部分靶向蛋白质组学技术分析IgA肾病尿液补体蛋白 背景：IgA肾病（IgA nephropathy，IgAN）发病核心环节是循环中增高的糖基化缺陷IgA1，补体在IgAN的发病机制中起重要作用。以往采用ELISA方法对IgAN中尿液补体蛋白进行了评估，并发现与疾病严重程度具有一定关联。目前缺乏利用靶向蛋白质组学技术探索IgAN不同补体活化通路尿液蛋白表达的研究。本研究利用平行反应监测(parallel reaction monitoring，PRM)技术解析IgAN患者尿液中补体蛋白变化，并分析其与临床及病理指标的相关性。 方法：纳入北京协和医院肾内科住院肾活检明确诊断的原发性IgAN患者64例，留取患者晨尿。丙酮提取尿液蛋白，进一步还原、烷基化、胰蛋白酶切及C18固相萃取除盐处理。选取27个感兴趣的补体蛋白通过Skyline软件在混合尿液样品中进行补体多肽筛选，所有样品经过反相C18毛细管色谱柱分离，利用Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪利用PRM方法对筛选到的补体蛋白在各个尿液样本中进行定量分析。鉴定到补体蛋白分成五类，包括经典途径(classical pathway，CP)，凝集素途径(lectin pathway，LP)，替代途径(alternative pathway，AP)调节蛋白，膜攻击复合物(membrane attack complex，MAC)及补体C3。将补体蛋白定量结果与IgAN患者临床及病理指标进行Spearman相关性分析。 结果：①入组64例患者，37例男性，27例女性，平均年龄40.37±12.80岁，eGFR为73.72±24.71ml/kg/1.73m2，24h尿蛋白定量为1.86±1.06g。 ②混合样品中共鉴定到30个尿液补体肽段，补体肽段定量中位CV值是0.45，82.8％补体肽段的CV值小于0.6，多数肽段定量稳定。 ③所有患者尿液中鉴定到19个补体蛋白，尿液补体C5与eGFR负相关。 ④尿液C3与尿蛋白正相关。补体LP中纤维蛋白2、甘露糖结合凝集素(mannose binding lectin，MBL)相关的丝氨酸蛋白酶-1均与尿蛋白负相关，C4a与尿蛋白正相关。AP中衰变加速因子(decay-accelerating factor,DAF)与尿蛋白负相关。 ⑤尿液C3与MEST-C评分正相关，DAF与MEST-C评分呈负相关，MAC中C9与MEST-C评分正相关。 结论：①尿液补体，特别是C3、C4a、MAC及DAF等与疾病严重程度有一定相关性; ②尿液补体变化提示替代及凝集素途径激活在IgAN发病中起突出作用。
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