摘要
瘙痒治疗的经典方法是抗组胺治疗，但绝大多数慢性瘙痒对抗组胺治疗无效，缺乏特异敏感的有效药物，是临床治疗的难点之一。慢性瘙痒虽然不对生命造成严重危害，但在普通人群中发病率高，极大地影响了人们的正常生活和休息。瘙痒的机制研究可以为开发安全有效治疗慢性瘙痒的药物提供实验基础，具有重要的科学意义。 随着痒感觉研究的不断深入，临床研究、动物实验和细胞研究均发现了雌激素在瘙痒调节中作用，在瘙痒传导的各个器官，包括从皮肤感受器、脊髓背根神经节、脊髓背角浅层、到下丘脑整合中枢，都发现了雌激素受体的表达，提示着雌激素可能在多器官、多位点对瘙痒发挥调节作用。但由于瘙痒感觉的研究起步较晚，又由于雌激素参与感觉调节的复杂性，雌激素在瘙痒感觉中的调节方式没有统一的结论。 本研究的主要内容为雌激素在瘙痒调节中的作用，全部研究分为四个部分，第一部分建立小鼠急性瘙痒模型，确立研究雌激素对急性瘙痒模型作用所用的致痒剂剂量;第二部分建立小鼠慢性干皮症瘙痒模型;第三部分实验研究雌激素对急性瘙痒模型的影响;第四部分实验研究雌激素对慢性瘙痒模型的影响，并通过分子生物学实验初步探讨雌激素调节慢性瘙痒的分子机制，为缓解慢性瘙痒的治疗提供可能的治疗靶点。 本实验方案均得到了中国医学科学院整形外科医院动物实验伦理委员会审核批准（伦理批准号:ZX201898，日期2018年12月）。 第一部分实验:小鼠急性瘙痒模型的建立 本部分实验旨在通过皮内注射不同浓度的致痒剂建立急性瘙痒模型，建立时间-搔抓曲线，计数小鼠总的搔抓次数，对比不同剂量药物引起小鼠瘙痒的情况，选择每组中抓挠次数在100～200次/30min的剂量做为第三部分实验中用到的致痒剂剂量 将20只9周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分成4组（每组5只）:低剂量组(L组)、中剂量组（M组）、高剂量组（H组）、对照组（C组）。选择急性瘙痒模型制备用到的5种致痒剂:组胺（Histamine）、氯喹(Chloroquine，CQ)、复合物48/80(Compound48/80)、蛋白酶激活受体-2（PAR-2）和5-羟色胺(5-HT)，根据以往的文献和预实验结果设计三种药物浓度，低剂量、中剂量和高剂量。观察皮内注射致痒剂引起的动物搔抓动作，确定动物的瘙痒程度。为使药物代谢完全，两种致痒物注射之间间隔3天。 具体方法为:小鼠清醒状态下皮内注射致痒剂后立刻将小鼠放回适应过的观察笼内，在安静、无人打扰的环境下持续拍摄小鼠活动40min，由另2位不知情分组情况的研究人员计数，记录小鼠的抓挠次数。计数方法为小鼠抬起后腿朝向颈部注射部位，抓挠一次或者连续抓挠多次，然后将该腿放下，这一系列的动作计为一次抓挠，抓挠其他部位不计数。 结果显示通过皮内注射致痒剂，可以有效的建立小鼠急性瘙痒模型，抓挠次数与药物剂量呈正相关，随着药物浓度增加，搔抓次数逐渐增加。氯喹100ug皮内注射小鼠的抓挠次数为(153.4±10.9);组胺200ug皮内注射小鼠的抓挠次数为(123.4±13.9);PAR-2100nmol皮内注射小鼠的抓挠次数为(118.0±13.3);compound48/8050ug皮内注射小鼠的抓挠次数为(150.2±11.2);5-HT50nmol皮内注射小鼠的抓挠次数为(152.6±17.0)。 设定此剂量为研究雌激素对急性瘙痒模型的致痒剂剂量。 第二部分实验:小鼠慢性瘙痒模型的建立 本部分实验旨在通过丙酮-乙醚-水(AEW)惯序涂抹方式制造小鼠干燥症瘙痒模型，评价雌性C57BL/6J小鼠慢性瘙痒模型的成功率，为探索雌激素在慢性瘙痒模型中的作用选择合适的慢性瘙痒模型。 将14只C57BL/6J9周龄雌性小鼠随机分为实验组（T组，n=7）和对照组(C组，n=7)。全部于每天上午9时和下午5时涂抹溶液。T组涂抹方式:用浸泡AE溶液（丙酮和乙醚等体积混合）的棉片在剃毛处涂抹15s，再用浸泡蒸馏水的棉片于同一部位涂抹30s，连续7d;C组涂抹方式:用棉片浸润蒸馏水涂抹同样的时间。由2位不知情分组情况的研究人员分别计数小鼠1h内的抓挠次数，计数方法同第一部分实验。判断建模的成功标准为小鼠自发性抓挠超过150次/h，表皮增厚、干燥、剥脱，瘙痒相关因子表达增加。 结果显示，随着造模时间的延长，T组小鼠组内比较各时间点的抓挠次数明显增多(P＜0.05);C组在不同的造模时间点对比，小鼠的抓挠次数比较差异无显著统计学意义(P＞0.05)。组间对比，第一天小鼠的抓挠次数两组间比较差异无显著统计学意义(P＞0.05);在造模第3、5、7天，T组小鼠抓挠次数明显多于C组(P＜0.05)。 造模第7天，T组小鼠病损处皮肤出现表皮干燥、剥脱、鳞屑，C组只有轻微的干燥;HE染色显示与C组相比，T组小鼠表皮明显增厚(P＜0.05);肥大细胞的数量在T组和与C组比较，差异无显著统计学意义(P＞0.05);与C组相比，T组皮肤和相应的脊神经节内，MrgprA3和TRPA1mRNA的表达明显增加(P＜0.05)。 造模成功率为100％，可以选择丙酮-乙醚-水(AEW)惯序涂抹制造的干皮症瘙痒模型作为慢性瘙痒模型。 第三部分实验:雌激素对小鼠急性瘙痒的影响 本部分实验旨在研究雌激素对小鼠急性瘙痒模型的影响。 将28只9周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分成高剂量雌激素组(E组，n=14)和低剂量雌激素组（P组，n=14）。E组小鼠卵巢切除后埋置雌激素缓释片，P组小鼠卵巢切除后埋置安慰剂，然后用不同雌激素水平的小鼠制备急性瘙痒模型。 对比卵巢切除手术前、后小鼠的体质量，确定小鼠的健康状态;在瘙痒模型制备前，通过滚轴试验（Rotarod）对比E组、P组小鼠运动能力。 在埋置药片10天后，进行皮下注射致痒物，比较E组、P组的急性瘙痒行为。为了使研究结果更加可靠，28只小鼠分成2部分进行实验，一部分完成氯喹、组胺、PAR-2的测试，一部分完成compound48/80和5-HT测试，为使药物完全代谢，不产生相互影响，每个行为学实验间隔3天。 结果显示，组间比较，手术前、后P组、E组体质量对比，差异均无显著统计学意义(P＞0.05);组内比较，P组、E组，手术后均比术前体质量略增加(P＜0.05);滚轴试验（Rotarod）测试小鼠的运动能力，两组小鼠的活动能力正常，组间比较差异无显著统计学意义(P＞0.05)。 与P组比较，皮内注射组胺200ug、氯喹100ug、5-HT50nmol、PAR-2100nmol compound48/8050ug引起的瘙痒在E组明显减少(P＜0.05)。 第四部分实验:雌激素在小鼠慢性瘙痒中作用的实验研究 本部分实验旨在研究雌激素对小鼠慢性瘙痒模型的影响及分子机制探讨。 将40只9周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分成空白对照组（C组，n=12），高剂量雌激素组（E组，n=16）和低剂量雌激素组（P组，n=12）。E组和P组处理方式同第三部分实验。 P组和E组小鼠按照第二部分实验方法建立小鼠干皮症瘙痒模型，C组只切除卵巢，不进行造模处理。通过大体标本观察各组变化，通过HE染色对比各组皮肤增厚情况。 在慢性干皮症瘙痒模型成功建立后提取DRG神经节中RNA，利用高通量测序筛选可能参与的瘙痒相关基因，用RT-PCR验证筛选的基因。提取各组颈背部皮肤以及血清，通过多因子测序实验(MSD)检测皮肤和血液中的炎症因子。最后用放免法检测各组血清中雌激素浓度。 在细胞层面，通过钙离子成像技术观察雌激素对组胺刺激神经元细胞引起的钙内流变化，探讨雌激素对瘙痒的影响。 实验结果表明，在慢性瘙痒实验中，造模第一天，各组小鼠的搔抓次数组间比较差异无显著统计学意义(P＞0.05);与C组比较，P组小鼠的的抓挠次数在造模第3、5、7天明显增加(P＜0.05);与C组比较，E组小鼠的抓挠次数在造模第3、5、7天也明显增加(P＜0.05);但与P组比较，E组的抓挠次数明显减少(P＜0.05)。大体标本观察，P组小鼠明显的表皮干燥、剥脱、呈现鳞屑，E组皮肤只表现为轻微干燥，表皮剥脱和鳞屑不明显;HE染色显示与C组比较，P组表皮明显增厚(P＜0.05);与P组比较，E组皮肤增厚程度明显减轻(P＜0.05);与C组比较，E组表皮明显增厚(P＜0.05)。 结论: 通过本研究四部分实验，改论文能够得到以下结论: 1.皮内注射致痒物可以引起小鼠的瘙痒感受，随着致痒剂剂量增加，代表瘙痒程度的抓挠次数也增多。 2.乙醚-丙酮-水惯序涂抹可以制造小鼠干燥症瘙痒模型，造模成功率100％。 3.高浓度雌激素水平可以抑制小鼠急性瘙痒。 4.高浓度雌激素水平可以抑制慢性干皮症引起的瘙痒。 4.高浓度雌激素抑制瘙痒感觉，与DRG中GPR、MrgprA3表达减少高度相关。 5.高浓度雌激素抑制瘙痒感觉，与炎症因子IL-6表达降低相关。 6.高浓度雌激素抑制组胺刺激背根神经节神经元细胞引起的钙离子内流，抑制了神经元细胞的激活作用。
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