摘要
目的： 放射治疗是非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）的常规治疗方法之一，可以单独使用或与手术、化疗、靶向和免疫等其他治疗方法联合使用以增强疗效。肿瘤局部控制率与放射治疗的剂量高度相关，然而由于危及器官的剂量限制，肿瘤区域剂量无法进一步提升。所以，探索能够提高肿瘤辐射敏感性的方法成为主要研究方向之一。长链非编码RNA（Long non coding RNA，lncRNA）在肿瘤中表达异常能够调控肿瘤的发生发展并且调节多种类型肿瘤的辐射敏感性。LncRNA主要通过竞争性内源RNA（Competing endogenous RNA，ceRNA）机制与微小RNA（microRNA，miRNA）相互作用调控mRNA的生物学功能而发挥效应。因此，lncRNA/miRNA/mRNA轴可能在调节NSCLC辐射敏感性中发挥重要作用。本研究基于该轴探讨影响NSCLC辐射敏感性相关分子机制，为NSCLC的精准放疗与RNA药物的联合应用提供新的增敏靶点和治疗策略。 方法： 1.筛选潜在调节辐射敏感性的lncRNA：对A549和A549-R11（获得性辐射抗性细胞株）细胞进行全转录组测序，发现lncRNA H19（H19）在辐射抗性的细胞中高表达，设计相应的si-H19序列。下调H19后，采用CCK-8和流式细胞术在X线辐照6Gy后24h、48h和72h检测A549和H460的细胞增殖能力和凋亡率；EdU实验检测辐照后两种细胞中DNA的合成能力。克隆形成实验检测下调H19后NSCLC细胞对X射线和碳离子的辐射敏感性。 2.生物信息学筛选与H19相结合的miRNA，并验证其功能：利用mirbase遴选与H19相互作用的候选miRNA，RT-PCR法对候选miRNA进一步筛选；双荧光素酶实验确定miR-130a-3p与H19的结合。RT-PCR检测miR-130a-3p minic在A549和H460细胞株中的过表达效率。在X线辐照6Gy后分别采用CCK-8、EdU、流式细胞术和克隆形成实验，检测miR-130a-3p过表达对NSCLC细胞增殖、DNA合成、细胞凋亡和辐射敏感性的影响。采用挽救实验进一步验证miR-130a-3p和H19之间的关系。 3.筛选miR-130a-3p的靶基因并验证功能：利用targetscan数据库筛选与miR-130a-3p相互作用的候选靶基因，通过与miR-130a-3p表达的相关性对候选靶基因进一步筛选，双荧光素酶实验确定miR-130a-3p与WNK3的结合。生物信息学方法分析WNK3在肺鳞癌、肺腺癌与正常肺组织之间的表达差异及对生存预后的影响。针对WNK3设计相应的siRNA，RT-PCR检测其在A549和H460细胞株中的沉默效率。沉默WNK3后，采用CCK-8和流式细胞术检测X线辐照6Gy后，NSCLC细胞增殖能力和凋亡率；EdU实验检测辐照后两种细胞中DNA的合成能力。克隆形成实验检测下调WNK3后NSCLC细胞对X射线辐射敏感性。利用Western blot检测凋亡相关分子cleaved-caspase3、PARP、p-p38、Bax和Bcl-2的表达水平。 4.在荷瘤裸鼠模型中验证H19的功能：构建过表达H19的A549-OEH19细胞株。皮下注射A549和A549-OEH19细胞构建BALB/c-nu荷瘤裸鼠模型，实验分为6组，即未照射组（A549和A549-OEH19）、4Gy X射线组（A549和A549-OEH19）和4Gy碳离子组（A549和A549-OEH19）。辐照后每3天测量肿瘤的大小并记录。21天后处死裸鼠剥离完整肿瘤组织，免疫组化法检测WNK3的表达水平。 结果： 1.辐照A549和H460细胞株后，与NC相比，沉默H19后的细胞增殖能力被抑制；在辐照后24h、48h和72h时，沉默H19显著增强辐射诱导的A549细胞和H460细胞凋亡率（p＜0.01）；与NC+辐照组对比，si-H19+辐照组细胞DNA合成能力显著降低（p＜0.001）；克隆形成结果显示，抑制H19的表达增加NSCLC细胞株对X射线和碳离子的辐射敏感性。 2.通过数据库遴选出57个与H19结合的miRNA；RT-PCR法进一步筛选与H19表达呈负相关的miRNA，在A549和H460两种细胞中，沉默H19后，miR-130a-3p表达均升高，表明H19可能与miR-130a-3p结合；双荧光素酶实验证实H19可与miR-130a-3p结合。在A549和H460细胞株中转染miR-130a-3p minic，可将miR-130a-3p的表达提高到NC组的118倍和187倍。辐照后48h和72h时，与NC+辐照组相比，miR-130a-3p minic+辐照组的NSCLC细胞增殖能力明显被抑制（p＜0.01）；细胞凋亡率显著增强（p＜0.05）。辐照后24h时，miR-130a-3p minic+辐照组细胞DNA合成能力被显著抑制（p＜0.01）；过表达miR-130a-3p能够增加NSCLC细胞株对X射线的敏感性。挽救实验表明，过表达H19所促进的细胞增殖效应可以被miR-130a-3p minic所抑制。 3.生物信息学分析显示，WNK3可能是miR-130a-3p的靶基因。在A549和H460细胞中过表达miR-130a-3p后WNK3表达下调，表明WNK3可能与miR-130a-3p结合；双荧光素酶实验证实了WNK3与miR-130a-3p直接结合。生物信息学分析结果示，与正常组织相比WNK3在肺鳞癌与肺腺癌组织中表达均升高；并且WNK3的表达与肺癌患者预后呈负相关。6Gy辐照A549和H460细胞株后，与NC相比，沉默WNK3后的细胞增殖能力被抑制；在辐照后24h、48h和72h时，沉默WNK3显著增强辐射诱导细胞的凋亡（p＜0.01）；与NC+辐照组对比，si-WNK3+辐照组细胞DNA合成能力显著降低（p＜0.01）；沉默WNK3可上调辐射诱导的Cleaved Caspase3和PARP蛋白的表达、增大Bax/Bcl-2的比值，并且下调p-p38蛋白的表达。克隆形成结果显示，抑制WNK3的表达增加NSCLC细胞株对X射线的辐射敏感性。 4.体内研究结果表明，与未照射组相比，X射线和碳离子辐照后对A549和A549-OEH19肿瘤体积均缩小（p＜0.05）。X射线或碳离子辐照后，A549组肿瘤体积小于A549-OEH19组的肿瘤体积（p＜0.05）。无论是A549细胞组还是A549-OEH19细胞组，WNK3免疫组化评分在碳离子辐照后最低，X射线辐照次之，未辐照评分最高。 结论： 1.H19/miR-130a-3p/WNK3轴通过调节细胞凋亡和细胞增殖效应，调节NSCLC细胞株的辐射敏感性，是影响NSCLC细胞辐射敏感性的分子机制之一。 2.H19影响X射线和碳离子对肿瘤生长的抑制效应。 3.H19可能是影响放射治疗效果的一个新靶标。
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