摘要
气候变化使地球变得越来越热，越来越干燥，干旱对农业、人类和家畜都是重要威胁，已经成为威胁全球粮食安全最重要的环境因子。分布于中国西北荒漠区的藜科植物梭梭（Haloxylon ammodendron）具有极强的抗旱、耐盐碱和耐贫瘠等特性，其在适应逆境过程中形成了独特的生理和分子机制，蕴含着丰富的抗逆基因资源。挖掘梭梭抗旱相关功能基因并应用于农作物和优良牧草的抗旱性遗传改良具有重要和深远的意义。ASR（ABA,stress and ripening induced protein）是植物体内一类重要的抗逆蛋白，具有转录因子和伴侣蛋白的双重功能，在植物生长发育以及响应逆境胁迫过程中发挥着重要作用。课题组前期通过对梭梭转录组测序分析发现HaASR2基因的表达受干旱显著诱导，表明其可能参与了梭梭适应干旱生境的过程；过表达HaASR2提高了干旱处理下拟南芥叶片相对含水量、脯氨酸和甜菜碱含量，增强了植株抗氧化能力而减少膜损伤。但对其蛋白性质、上下游调控机制等尚不清楚。本研究以梭梭和过表达HaASR2拟南芥为研究材料，克隆HaASR2启动子并分析其上游调控序列，对模拟干旱处理下的拟南芥野生型和过表达HaASR2植株进行转录组测序和比对分析，构建HaASR2原核表达载体转化大肠杆菌感受态进行HaASR2蛋白纯化并测定其二级结构，取得如下主要研究结果： 1.克隆到长约1332bp的HaASR2启动子，其含有启动子核心元件以及干旱响应元件、激素响应元件和光诱导调控元件等；转拟南芥GUS染色实验表明，HaASR2启动子具有驱动活性，其在根中的表达量更高，其次是叶中；构建得到不同长度5''端缺失启动子表达载体，农杆菌介导瞬时转化烟草叶片和GUS染色表明不同长度HaASR2的5''端缺失片段启动子均能驱动GUS报告基因表达，未发现减弱子和增强子存在，表明HaASR2启动子核心区域小于371bp。 2.对三周龄野生型、过表达HaASR2拟南芥株系在正常和渗透胁迫条件下进行转录组测序和比对分析，发现对照组地上部共有1103个差异表达基因，处理组地上部共有406个差异表达基因，对照组根中共有1065个差异表达基因，处理组根中共有896个差异表达基因；GO功能富集发现处理组差异表达基因主要富集在铁离子转运、活性氧响应、乙烯响应、非生物胁迫响应等方面；进一步分析发现，HaASR2可能通过直接或间接的作用提高乙烯相关基因表达来调控抗旱性，提高铁离子转运和铁蛋白相关基因的表达来提高营养元素吸收并维持光合能力，提高POD等抗氧化相关基因的表达来减缓氧化胁迫，提高海藻糖和脯氨酸合成相关基因的表达来增强渗透调节能力。 3.对HaASR2基因开放阅读框序列进行原核密码子优化使密码子适应指数CAI=1，并将优化后的HaASR2序列亚克隆到大肠杆菌表达载体pET28a并转化BL21（DE3）感受态；经组氨酸亲和层析法纯化以及质谱鉴定得到了全长107个氨基酸且不带有His标签的HaASR2蛋白，利用生物信息学分析和圆二色谱测定蛋白质二级结构确定HaASR2蛋白是固有无序家族蛋白（IDPs）；在纯化阶段HaASR2蛋白表现出了金属离子结合能力，推测其可以结合金属离子来改变蛋白构象，从而发挥转录因子及伴侣蛋白的功能。 以上结果表明，HaASR2基因上游含有多种顺式作用元件，可能受到环境、激素、光照等多种信号的诱导表达，下游可能通过直接或间接的途径调控铁离子转运、乙烯响应、渗透调节物质、活性氧清除等相关基因；HaASR2蛋白属于固有无序蛋白，具有金属离子结合能力，推测其可作为伴侣蛋白发挥保护作用，在梭梭适应干旱生境中发挥着重要作用。
NETL