摘要
本文主要从以下几个部分展开论述： 第一部分 基于单细胞转录组测序技术探索肿瘤微环境在垂体神经内分泌肿瘤发生机制研究 研究目的: 垂体神经内分泌肿瘤(pituitary neuroendocrine tumors，PitNETs)是来源于腺垂体细胞的神经内分泌肿瘤，功能性和无功能PitNETs由于导致激素分泌异常、肿瘤压迫效应和/或侵袭周围组织，严重影响患者的生活质量和预期寿命，其中难治性及侵袭性PitNETs是临床治疗中的重要挑战。目前发现多种因素参与PitNETs的发生，包括GNAS、AIP、USP8、MEN1等单基因缺陷、表观遗传学和细胞周期调节因子表达异常等，近年来发现肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)也在PitNETs的侵袭和治疗反应中发挥重要作用。PitNETs的分型复杂、肿瘤亚型较多，发生机制尚未完全阐明。单细胞转录组测序(Single cell RNA sequencing，scRNA-seq)是在单细胞水平对转录组进行测序的新技术，可借助该项技术研究单个细胞内的基因表达情况，同时解决既往组织样本测序中无法解决的细胞异质性难题，为深入理解PitNETs中单个细胞的行为、发生机制提供了重要基础。因此，本研究旨在利用scRNA-seq构建PitNETs的单细胞转录组图谱，并探索TME在PitNETs发生机制中的作用;进一步阐释与肿瘤发生发展相关的细胞亚群的分子特征和动态变化，寻找潜在的生物学标志物，为未来筛选药物治疗靶点提供理论依据。 研究方法: 收集11例接受PitNETs切除手术患者的新鲜组织样本，临床无功能PitNETs(non-functioning，NF-PitNETs)包括2例零细胞瘤、2例PIT-1和PRL免疫组化染色阳性的无功能瘤（PIT-1+NF）、2例静息型促肾上腺皮质激素肿瘤(silent corticotroph adenomas，SCA)，功能性PitNETs包括2例生长激素(growth hormone，GH)瘤，2例泌乳素(prolactin，PRL)瘤和1例促甲状腺激素（thyrotropin，TSH）瘤。通过单细胞悬液制备进行scRNA-seq，对测序后的原始数据进行信息处理、降维聚类、细胞注释，针对主要细胞簇进行差异表达分析、基因富集分析、细胞通讯分析、细胞轨迹拟时序分析、转录因子（transcription factors，TFs）模块分析。其中在内分泌细胞采用Infer-CNV区分内分泌肿瘤细胞和正常细胞，T细胞和单核/巨噬细胞中分别进行亚群特征性评分。 研究结果: 1.垂体神经内分泌肿瘤的单细胞图谱概况 根据已知标志物基因在细胞簇的表达情况，注释并确定了八种主要细胞簇，分别为内分泌细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤(Natural killer，NK)细胞、内皮细胞、中性粒细胞、B细胞、上皮细胞和间质细胞，其中内分泌细胞的比例最高。PitNETs亚型的主要细胞成分及比例显示出明显差异，功能性PitNETs中内分泌细胞比例最高，与临床表现及免疫组化结果一致。而零细胞瘤和PIT-1+NF表现为免疫细胞的富集，内分泌细胞含量相对较少，其中单核/巨噬细胞和T淋巴细胞比例较高。SCA无相关激素高分泌的临床表现，却表现出与功能性肿瘤相似的细胞成分，即内分泌细胞的比例更高。细胞通讯分析表明，单核/巨噬细胞和中性粒细胞与内分泌细胞的联系最紧密，GH、PRL、TSH瘤和SCA的细胞间通讯能力总体较强，零细胞瘤和PIT-1+NF的通讯能力较弱，但单核/巨噬细胞仍然显示出较强的细胞间相互作用。 2.垂体神经内分泌肿瘤中内分泌细胞的单细胞转录组特征 将35，111个内分泌细胞细分为七个细胞亚群:泌乳素细胞的比例最高(28％)，其次为促甲状激素细胞(23％)、生长激素细胞(21％)和促肾上腺皮质激素细胞(18％)，以及促性腺激素细胞、干细胞和增殖型Pou1f1细胞亚群。功能性和无功能PitNETs的内分泌细胞构成存在异质性，功能性PitNETs和SCA的大部分内分泌细胞为单一激素分泌性细胞，零细胞瘤及PIT-1+NF则成分复杂，并包含一定比例的干细胞。干细胞细分为三个亚群，Stem1和Stem2细胞主要存在于无功能瘤，而Stem3主要来自GH和PRL瘤。通路富集分析发现Stem1主要与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组织和胶原蛋白的功能相关，Stem2富集到MHCⅡ复合物，内质网膜、以及网格蛋白包被的内吞囊泡膜等通路，而Stem3细胞则与细胞间连接、质膜、囊泡腔相关。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、干扰素(interferon，IFN)、上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）、血管生成和Notch信号也在干细胞显著激活。 研究结论: PitNETs亚型的内分泌细胞、T淋巴细胞和单核/巨噬细胞的构成和功能均存在异质性，不同亚型内分泌肿瘤细胞功能的差异提示肿瘤发生机制和治疗靶点的差异;本研究在单细胞层面阐述PitNETs的TME中T细胞和单核/巨噬细胞的详细特征、功能和发育轨迹，为免疫相关的诊断和和治疗靶点的选择提供新的见解。 第二部分 基于单细胞转录组测序技术的TPIT谱系垂体神经内分泌肿瘤的发生机制研究 研究目的: SCA是一种特殊的临床无功能PitNETs，与垂体ACTH腺瘤相比，SCA患者通常缺乏皮质醇增多的临床表现，但病理表现为ACTH和/或TPIT阳性。过去临床上将SCA定义为无功能腺瘤，然而SCA的侵袭性和增殖性较强，容易复发，并且存在SCA转为功能性ACTH腺瘤的现象，患者的临床结局差异很大，因此需要探索SCA的发生机制。而垂体ACTH腺瘤非常罕见，治疗缓解率低于其他功能性肿瘤，易复发的特点导致其治疗仍然是一个世界性难题。目前SCA和垂体ACTH腺瘤的发生机制尚未完全阐明。本研究旨在利用scRNA-seq构建TPIT谱系垂体神经内分泌肿瘤的单细胞图谱，并探索TME在肿瘤发生和进展中的作用，为寻找潜在的生物学标志物和药物靶点提供理论依据。 研究方法: 收集6例TPIT谱系垂体神经内分泌肿瘤的新鲜组织样本，包括2例SCA和4例CD。通过单细胞悬液制备进行scRNA-seq，对测序后的原始数据进行信息处理、降维聚类、细胞注释。在内分泌细胞采用Infer-CNV区分内分泌肿瘤细胞和正常细胞。对内分泌细胞和单核/巨噬细胞进行差异表达分析、基因富集分析、细胞通讯分析、拟时序分析以及单核/巨噬细胞特性评分。 研究结果: 1.TPIT谱系垂体神经内分泌肿瘤的单细胞图谱概况 SCA和垂体ACTH腺瘤(Cushing''s disease，CD)的主要细胞构成相似，内分泌细胞比例最高，其次为单核/巨噬细胞。不同的是，CD中NK细胞、中性粒细胞和T淋巴细胞的比例较SCA更高，并且观察到一定比例的上皮间充质细胞。细胞通讯分析表明，内分泌细胞与单核/巨噬细胞的联系最紧密，其次为中性粒细胞。与CD相比，SCA的细胞间通讯更强，内分泌细胞与其他主要细胞簇之间存在更强的相互作用。 2.SCA和CD内分泌细胞的单细胞转录组特征 SCA和CD的内分泌细胞组成和功能具有异质性。CD中促肾上腺皮质激素细胞数量最多，而SCA中可能存在一种特殊的细胞，处于从干细胞向促肾上腺皮质激素细胞分化的中间状态，因此同时表现出促肾上腺皮质激素细胞和干细胞的特征。SCA与CD具有肿瘤内异质性，并表现出与免疫组化结果的差异。GO分析表明，促肾上腺皮质激素细胞中神经细胞胞体、性别决定和肾上腺发育等通路激活。此外，也富集到与细胞膜结构相关的膜筏、膜微结构域、膜区，与肌肉收缩和能量代谢相关的肌浆网、肌质体（线粒体）相关的通路。KEGG分析发现促肾上腺皮质激素细胞与细胞凋亡和p53信号通路相关。与其他内分泌细胞亚群相比，促肾上腺皮质激素细胞和TBX19+干细胞中多条代谢通路激活，提示存在活跃的生物合成代谢活动。拟时序分析表明促肾上腺皮质激素细胞与干细胞的发育轨迹存在重叠，提示促肾上腺皮质激素细胞中可能存在不同特征的亚群，出现在垂体细胞分化的不同时期。 SCA和CD的内分泌细胞功能存在异质性，GO分析表明CD富集到神经细胞胞体、激素活动、神经肽激素活动的通路，SCA则与配体结合结构域相关。SCA还表现出活跃的合成和代谢活动，SCA中氧化磷酸化、三羧酸循环、脂肪酸、氨基酸代谢等多条通路高度激活，而在CD中这些通路失活。 研究结论: 构建TPIT谱系垂体神经内分泌肿瘤的单细胞图谱，揭示SCA和垂体ACTH腺瘤的内分泌细胞与单核/巨噬细胞的成分和功能具有异质性。SCA与垂体ACTH腺瘤的内分泌细胞性质不同，SCA的内分泌肿瘤细胞中POMC的转录下调、核糖体及蛋白质的胞内转运存在异常，SCA与垂体ACTH腺瘤的单核/巨噬细胞通路活性的差异，可能是两种肿瘤表现为功能性及沉默的原因。
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