摘要
本文从以下三部分进行阐述： 第1部分：系统性硬化症小鼠模型的建立 目的：通过对比注射不同浓度博来霉素后小鼠皮肤和肺纤维化的程度及小鼠的大体状态，选择同时存在皮肤和肺纤维化且死亡率低的硬皮病小鼠模型用于进一步的干预研究。 方法：应用两种不同浓度的博来霉素(Bleomycin，BLM)(0.5mg/ml、1mg/ml)或PBS（对照组）连续皮下注射（0.1ml/次，1次/天）C57BL/6小鼠共28天。观察3组小鼠体重变化，28天时皮肤和肺的纤维化情况。主要观察的指标：小鼠体重，苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察肺、注射处皮肤及肺组织的病理改变;肺组织马松(Masson)染色纤维化评分及注射处皮肤Masson染色厚度测量;使用羟脯氨酸(hydroxyprolein，HYP)试剂盒测定肺组织及注射处皮肤的HYP含量的变化。 结果：1.高剂量组(1mg/mlBLM，n=7)和低剂量组(0.5mg/mlBLM，n=7)小鼠第8天开始体重明显低于对照组(n=6)(16.6g比19.1g，P=0.002;17.9g比19.1g，P=0.035);高剂量组小鼠第10天开始体重明显低于低剂量组(15.7g比17.7g，P=0.023)。高剂量组小鼠大体状态最差，低剂量组次之;每组取3只小鼠进行下面的检测;2.HE染色：低剂量组与高剂量组小鼠肺组织和皮肤均可见明显纤维化病理改变;3.Masson染色：(1)三组小鼠肺Asheroft评分为：对照组3只(100％)0分;低剂量组1只(33.3％)3分，2只(66.7％)4分;高剂量组3只(100％)7分;低剂量组与对照组比较、高剂量组与对照组比较差异均有统计学意义(p＜0.05)，低剂量组与高剂量组比较差异无统计学意义(p＞0.05)。(2)三组小鼠真皮厚度为：对照组(186.93±9.11)μm，低剂量组(416.99±58.27)μm，高剂量组(438.48±118.20)μm;低剂量组与对照组比较p=0.022，高剂量组与对照组比较p=0.024，低剂量组与高剂量组比较p=0.100;4.羟脯氨酸含量：(1)皮肤：对照组2.84(2.73-2.92)μg/mg，低剂量组3.27（3.21-3.45）μg/mg，高剂量组7.75(6.89-9.13)μg/mg;除高剂量组与对照组间比较p=0.022外，其余均无统计学意义;(2)肺：对照组(1.11±0.04)μm，低剂量组(1.22±0.18)μm，高剂量组(1.03±0.14)μm;组间比较p均＞0.05。 结论：皮下注射低剂量BLM与高剂量BLM均成功造出皮肤及肺纤维化的SSc小鼠模型，高剂量组小鼠皮肤和肺纤维化程度高于低剂量组，体重更轻，状态更差。 第2部分：胎盘间充质干细胞在系统性硬化症小鼠中的作用 目的：通过不同治疗方案应用胎盘间充质干细胞(PMSCs)治疗SSc模型小鼠，探讨PMSCs对SSc小鼠皮肤及肺纤维化的治疗作用。 方法：小鼠随机分组（正常对照组、模型组、治疗组）。建模阶段：治疗组与模型组均注射BLM0.8mg/ml0.1ml/日，正常对照组每天注射相同体积的PBS，持续28天;治疗阶段：正常对照组（A组）、模型组（B组）、治疗组（C组）根据治疗方案不同各分为4组：C1组：建模第14天小鼠尾静脉注射1×106个人PMSCs，第28天时处死（C1a组），第42天时处死(C1b组);A1组、B1组在建模第14天小鼠尾静脉注射200μl的生理盐水，A1a、B1a组在第28天处死，A1b、B1b组在第42天处死;C2组：建模第14天和第28天小鼠尾静脉各注射1×106个人PMSCs，第42天时处死（C2a组），第56天时处死（C2b组）。A2组、B2组在建模第14天和第28天分别小鼠尾静脉注射200μl生理盐水，A2a、B2a组在第42天处死，A2b、B2b组在第56天处死。主要观察指标：小鼠体重;肺组织苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色Szapiel肺泡炎症和纤维化评分;肺组织马松(Masson)染色纤维化评分及注射处皮肤Masson染色厚度测量。 结果：4组小鼠中，处死时，1a各组：(1)肺泡炎症评分：正常对照组有1只(100％)无肺泡炎症，模型组有2只(66.7％)轻度肺泡炎症、1只(33.3％)重度肺泡炎症，治疗组有2只(28.6％)无肺泡炎症、4只(57.1％)轻度肺泡炎症、1只(14.3％)中度肺泡炎症，模型组与治疗组比较p=0.583;(2)肺纤维化评分：正常对照组有1只(100％)无肺纤维化，模型组有2只(66.7％)中度肺纤维化、1只(33.3％)重度肺纤维化，治疗组有2只(28.6％)轻度肺纤维化、5只(71.4％)中度肺纤维化，模型组与治疗组比较p=0.358;(3)背部真皮厚度：治疗组、模型组和正常对照组真皮厚度分别为(294.35±30.70)μm，(274.07±22.46)μm，180.25μm，模型组与治疗组比较p=0.338。1b各组：(1)肺泡炎症评分：正常对照组1只(100％)无肺泡炎症，模型组2只(100％)中度肺泡炎症，治疗组4只(100％)轻度肺泡炎症，模型组与治疗组比较p=0.067;(2)肺纤维化评分：正常对照组有1只(100％)无肺纤维化，模型组有1只(50.0％)中度肺纤维化、1只(50.0％)重度肺纤维化，治疗组有1只(25.0％)轻度肺纤维化、3只(75.0％)中度肺纤维化，模型组与治疗组比较p=0.600;(3)背部真皮厚度：治疗组、模型组和正常对照组真皮厚度分别为(254.32±34.26)μm，(241.36±23.57)μm，164.20μm，模型组与治疗组比较p=0.663;2a各组：(1)肺泡炎症评分：正常对照组有1只(100％)无肺泡炎症，模型组2只(66.7％)轻度肺泡炎症、1只(33.3％)中度肺泡炎症，治疗组有4只(80.0％)轻度肺泡炎症、1只(20.0％)中度肺泡炎症，模型组与治疗组比较p=1.000＞0.05;(2)肺纤维化评分：正常对照组有1只(100％)无肺纤维化，模型组有1只(33.3％)轻度肺纤维化、2只(66.7％)中度肺纤维化，治疗组有1只(20.0％)轻度肺纤维化、4只(80.0％)中度肺纤维化，模型组与治疗组比较p=1.000;(3)背部真皮厚度：治疗组、模型组和正常对照组真皮厚度分别为(291.60±71.07)μm，(291.36±59.61)μm，160.49μm，模型组与治疗组比较p=0.996;2b各组：因C2b组小鼠只剩余1只存活，未进一步进行统计分析。(1)肺泡炎症评分：正常对照组有1只(100％)无肺泡炎症，模型组有1只(50％)无肺泡炎症、1只(50％)轻度肺泡炎症，治疗组有1只(100％)中度肺泡炎症;(2)肺纤维化评分：正常对照组有1只(100％)无肺纤维化，模型组有1只(50％)轻度肺纤维化、1只(50％)中度肺纤维化，治疗组有1只(100％)中度肺纤维化;(3)背部真皮厚度：治疗组、模型组和正常对照组真皮厚度分别为219.75μm，(475.93±0.87)μm，153.09μm，治疗组真皮厚度低于模型组。 结论：PMSCs对博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化和肺纤维化的治疗效果不明确，有待于进一步增加样本量证实。 第3部分：胎盘间充质干细胞在硬皮病小鼠模型体内的分布和定植 目的：探讨胎盘间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)在硬皮病模型小鼠体内的分布和代谢情况。 方法：小鼠随机分成正常对照组和治疗组，治疗组连续注射0.8mg/ml博来霉素(Bleomycin，BLM)(0.1ml/次，1次/天)14天，正常对照组每日注射0.1ml/次PBS。。建模第14天两组均由小鼠尾静脉注射200μl（含细胞数1×106个）DiR标记的人PMSCs，并于注射第0h、6h、24h、48h、72h、1周、2周、3周、4周进行动物活体成像，观察PMSCs在硬皮病小鼠模型体内的分布和定植情况;小鼠死亡或处死后肺组织进行荧光冰冻切片成像。 结果：整体荧光成像：正常对照组DiR荧光强度主要聚集在腹腔，在24h达到峰值，到第48h开始急剧下降，1周时消失。在模型组中，1h时荧光强度主要集中于肺（胸腔），肝脏（腹腔）也可见，总荧光强度逐渐增大，24h时达到最大，之后逐渐降低，1周时肉眼不可见肺部荧光，仅剩微弱肝脏荧光，其后继续减弱，3周时肉眼完全不可见荧光。肺组织荧光冰冻切片：模型组肺组织切片第1h时((1.98×109±3.48×108)p/s/cm2/sr)显著高于第3周时((1.33×108±6.30×107)p/s/cm2/sr)，p=0.004，差异有统计学意义;第3周时，模型组肺组织平均荧光强度((1.33×108±6.30×107)p/s/cm2/sr)数值上高于正常对照组((1.45×107±2.89×107)p/s/cm2/sr），p=0.077，差异没有统计学意义。 结论：与正常对照组相比，DiR-MSCs在模型组小鼠的肺组织更易聚集，1周左右荧光显著减弱。应进一步进行不同时间点肺组织、肝脏荧光切片显像以便准确评估MSCs的分布。
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