摘要
研究背景及目的： 结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是影响中国及全球健康的最重要的恶性疾病之一，发病率及死亡率均位居前列。根治性切除术是CRC最重要的治疗方法之一，但仍有约30-40％的患者术后会出现复发、转移。肿瘤的局部复发和远处转移是CRC患者死亡的主要原因，肿瘤细胞的免疫逃逸在其中发挥了重要的作用。作为重要的免疫检查点，程序性死亡受体配体-1(Programmed cell death ligand1，PD-L1)与程序性死亡受体-1(Programmed cell death protein1，PD-1)结合后可以造成T细胞功能抑制、促进肿瘤细胞免疫逃逸。PD-L1在多种肿瘤中高表达，并与更差的预后、更晚的临床分期相关。肿瘤细胞中PD-L1表达的上调受到多种机制调节，肿瘤微环境在其中发挥了不可或缺的作用。肿瘤相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts，CAFs)是肿瘤微环境中最重要的组成部分之一，已有研究表明CAFs可以促进结直肠癌肿瘤细胞的生长和生存，促进异常新生血管的形成及远处转移，导致CRC患者的肿瘤进展和不良预后。CAFs还被证实可以上调肿瘤细胞中PD-L1的表达，但其机制尚未完全明确，因此，本研究计划探索CAFs对CRC中PD-L1表达、免疫逃逸的影响，并明确其中具体的调节机制，以期待为CRC的治疗提供潜在的治疗靶点、改善CRC患者的预后。 研究方法： 1.首先使用结直肠癌细胞系来源的外泌体培养间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，利用Western blot、多能分化诱导实验验证并鉴定CAFs特征。 2.检测外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)对不同处理组的结直肠癌细胞系的杀伤作用，来验证CAFs对结直肠癌细胞系免疫逃逸功能的影响，即:分别用CAFs条件培养基(CAF-CM)、普通培养基（对照组）培养结直肠癌细胞系，随后使用健康志愿者的PBMCs分别对肿瘤细胞进行杀伤，最后利用MTS法检测存活的肿瘤细胞、流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡率，来评价肿瘤细胞的免疫逃逸功能。并进一步应用Western Blot、RT-qPCR验证结直肠癌细胞系的免疫逃逸与PD-L1表达水平的相关性。 3.确定关键信号通路:利用Western Blot、RT-qPCR检测参与调节PD-L1表达的信号通路中的关键因子，明确其与CRC细胞系中PD-L1表达的关系，随后采用细胞杀伤实验验证上述关键信号因子与结直肠癌细胞系免疫逃逸的相关性。 4.纳入根治性切除术后的CRC患者，收集患者的临床、病理资料，对患者的病理组织标本进行免疫组化染色，并分析临床病理特征、CAFs、CAFs调控结直肠癌PD-L1表达的信号通路关键因子、PD-L1的表达与预后的相关性。 研究结果： 1.纯化提取结直肠癌细胞系来源的外泌体诱导MSCs分化为CAFs，CAFs的特征性蛋白α-SMA和FAPA蛋白显著上调、多分化能力显著下降。 2.PBMCs分别与CAF-CM或者对照的普通培养基处理的结直肠癌细胞系共培养，结果显示PBMCs对CAF-CM处理结直肠癌细胞系的杀伤率显著低于普通培养基处理的对照组细胞系，表明前者的免疫逃逸能力显著增强。Western Blot及RT-qPCR结果表明经CAF-CM处理的结直肠癌细胞系PD-L1的表达水平显著升高，CAF-CM处理的结直肠癌细胞系Akt、ERK、NF-κB p65、STAT3磷酸化水平也显著上调。 3.在培养体系中加入Akt、ERK、NF-κB p65、STAT3磷酸化抑制剂后，只有Akt磷酸化抑制剂(pAkti)可以导致CAF-CM处理的结直肠癌细胞系PD-L1表达上调显著减弱，同时PBMCs对结直肠癌细胞系的杀伤能力显著增强。进一步在CAF-CM培养的结直肠癌细胞系中加入抗PD-L1单克隆抗体(αPD-L1)后，阻断PD-L1组、阻断Akt磷酸化组、二者共同阻断组的PBMCs对结直肠癌细胞的杀伤率没有显著差异，但均显著高于对照组（CAF-CM培养组），从而说明CAFs是通过结直肠癌中的Akt磷酸化导致的PD-L1表达上调促进结直肠癌免疫逃逸。 4.纳入研究的102例结直肠癌患者均接受了R0切除手术，其中男性49人，女性53人，Ⅱ期患者65例(63.7％)，Ⅲ期患者37例(36.3％)。免疫组化分析发现39.2％(40/102)的患者肿瘤细胞PD-L1表达阳性，19.6％(20/102)的患者p-Akt表达阳性，24.5％(25/102)的患者α-SMA高表达。PD-L1的表达与p-Akt(Spearman R=0.213，P=0.031)和α-SMA(Spearman R=0.246，P=0.012)的表达呈正相关。PD-L1阳性表达与肿瘤分期更晚相关(x2=7.808，P=0.005)，PD-L1、p-Akt和α-SMA的表达与患者的年龄、性别、肿瘤分化程度无显著相关性(P＞0.05)。PD-L1阳性患者的无病生存期(DFS)显著小于PD-L1表达阴性者（P=0.011）;α-SMA高表达(α-SMAhigh)患者的DFS显著小于α-SMA低表达者(P=0.025);p-Akt表达阳性患者的DFS有缩短趋势，但结果无统计学差异(P=0.132);PD-L1、pAkt和α-SMAhigh表达均阳性患者的DFS显著短于三种蛋白表达均阴性的患者(P＜0.001)。 研究结论： 1.CAFs通过调控结直肠癌细胞Akt磷酸化上调PD-L1表达进而促进结直肠癌免疫逃逸; 2.PD-L1、pAkt和α-SMAhigh蛋白均表达的结直肠癌患者预后更差。
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