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吲哚胺-2，3-双加氧酶1的原核表达纯化
迪丽扎泰·赛米1
作者信息
摘要
目的:吲哚胺-2，3-双加氧酶1(Indole2，3-dioxygenase1，IDO1)是存在于细胞内的含亚铁血红素的单体蛋白质类酶，它在肿瘤免疫逃逸中发挥着关键的作用。结构完整且有活性的IDO1的纯化是其抑制剂研发的前提条件之一。因此，用快速、简易且经济的方式纯化出具有生物学活性的IDO1具有较重要的科学价值。 方法:(1)利用多种在线数据库对IDO1进行生物信息学分析;(2)通过PCR扩增的方法构建表达载体，然后利用琼脂糖凝胶电泳技术和测序技术检测重组质粒是否构建正确;(3)此重组质粒在E coli Rosetta(DE3)菌株中表达IDO1，通过Strep-Tactin磁珠进行蛋白质亲和层析;(4)将纯化后的蛋白加入含有色氨酸的反应体系中，37℃孵育后，采用高效液相色谱检测反应体系中的犬尿氨酸，以鉴定纯化的蛋白是否有活性并计算其米氏常数;(5)用纯化后的重组IDO1-strep蛋白免疫小鼠后，利用眼球取血法获得小鼠血清。通过酶联免疫法、免疫荧光技术和Western blot的方法验证血清中抗IDO1抗体的效价。 结果:(1)基于生信分析结果显示，IDO1基因在胶质瘤组织中较正常脑组织表达更高，并且随着胶质瘤恶性程度变高，其表达也逐渐升高。IDO1表达水平对胶质瘤患者总体生存率(Overall Survival，OS)具有显著影响，并且IDO1基因编码的蛋白质会发生错义突变和剪接体突变，而IDO1突变患者的OS要显著高于IDO1未突变患者;(2)根据测序结果显示，成功获得了IDO1-strep的表达载体;(3)考马斯亮蓝结果显示，通过Strep-Tactin磁珠纯化的方式得到了纯度较高的蛋白;(4)纯化出的蛋白在能够将色氨酸催化成犬尿氨酸，具有生物学活性，其Km值为0.3015mM，kcat值为36.5min-1;(5)用ELISA检测血清中IDO1多克隆抗体的效价。结果表明制备的小鼠抗IDO1血清效价大于1∶16000。Western blot和免疫荧光的结果表明小鼠抗IDO1血清既能识别纯化的IDO1，又能识别内源性的IDO1。 结论:本研究利用Strep蛋白标签纯化得到的稳定性和均一性良好的高纯度IDO1，有利于未来针对其结构筛选出更有效的抑制剂。本研究具有重要的实际应用价值，它首次报道了基于Strep蛋白标签的IDO1纯化，并为进一步研究IDO1蛋白功能提供了实验基础。
关键词
吲哚胺-2,3-双加氧酶1抑制剂/原核表达纯化/肿瘤免疫逃逸/生物学活性引用本文复制引用
授予学位
硕士学科专业
免疫学导师
刘玉英学位年度
2022学位授予单位
北京协和医学院语种
中文中图分类号
R9