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水通道蛋白AQP1在慢性血栓栓塞性肺动脉高压中对血管平滑肌细胞线粒体的调节机制研究

王峰
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水通道蛋白AQP1在慢性血栓栓塞性肺动脉高压中对血管平滑肌细胞线粒体的调节机制研究

王峰1
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作者信息

  • 1. 北京协和医学院
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摘要

目的: 慢性血栓栓塞性肺动脉高压(Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension，CTEPH)是肺动脉高压(Pulmonary Hypertension，PH)的一种特殊类型，属于第四类，是由于肺动脉原位或异位的血栓到达肺动脉后不溶解、血栓机化，在各种神经体液因子的共同作用导致肺动脉内膜的增厚，最终导致肺动脉压力增加、肺动脉压力与肺通气血流比例的失调，进一步进展为呼吸困难和心力衰竭，甚至死亡。虽然目前数据报道的CTEPH发生率很低，但实际发病率应该比现如今报道的数据要多。同时，CTEPH患者的预后非常差，有研究显示未经任何治疗的CTEPH患者平均生存期约为2.8年，且1、3、5年的生存率分别为68％、48％及34％。综上，由于CTEPH高发病率和高死亡率，所以加强其相关的治疗迫在眉睫。 CTEPH作为肺动脉高压的一种特殊类型，具有和其他类型肺动脉高压不同的病理生理学特点。研究表明，CTEPH典型的组织病理学特点为肺血栓引起肺小动脉平滑肌细胞和血管内皮细胞的增殖与肺血管狭窄，肺血管阻力增加，最终导致血栓性的肺动脉高压。 其中肺动脉中膜血管平滑肌细胞异常增殖与迁移促进中膜增厚引起的肺血管重塑被认为是促进CTEPH的关键步骤。 水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）家族是一类普遍表达在哺乳动物细胞膜上的水分子转运相关蛋白，对维持细胞内水平衡起着关键的作用，到目前为止已经发现有13种AQP，分别为AQP0～AQP12。AQP家族蛋白的各个亚型分布在不同的器官组织，包括内皮细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等，除了作为水通道蛋白调节水的运输外，不同亚型在不同器官组织的表达和功能又有一定的特异性。早期学者们对AQP的研究主要集中在肾脏、脑水肿、腺体分泌等过程中。但是随着研究的不断深入，发现AQP对细胞的迁移能力越来越重要，在疾病的发生发展中发挥着重要的作用。同时，AQPs作为一类小型水转运膜蛋白家族也参与包括心血管疾病在内的多种疾病的在内的病理过程。测序结果显示，水通道蛋白1(Aquaporins1，AQP1)在CTEPH来源的VSMCs的所有AQP亚型中表达最高的，其他研究也表明过表达AQP1参与肿瘤细胞增殖、迁移和血管生成。但到目前为止，还没有直接的证据表明AQP1在CTEPH发病机制中的作用。因此，本研究主要针对AQP1在CTEPH中对血管平滑肌细胞影响的机制研究。 方法: 将来源于正常供体肺动脉和CTEPH患者来源的原代血管平滑肌细胞进行RNA-Seq测序并观察其富集功能;通过PCR技术检测AQP家族蛋白各亚型在CTEPH病理过程中的作用;随后利用PCR技术探讨CTEPH患者剥脱下来的肺动脉内膜组织中AQP1与其相对应患者的临床症状（包括平均肺动脉压和肺血管阻力）的相关性;之后通过Western Blot、PCR等方法检测在正常供体肺动脉和CTEPH组剥脱下来的肺动脉增生内膜样本以及两者来源的血管平滑肌细胞中AQP1的表达水平;在体外实验中，在人（包括正常供体肺动脉和CTEPH患者剥脱下来的增生内膜）原代血管平滑肌细胞通过划痕实验、CCK8、Transwell、Western Blot、PCR等方法观察降低AQP1（包括小干扰RNA siAQP1和AQP1通道抑制剂BacopasideⅡ）后对血管平滑肌细胞增殖与迁移功能的影响;课题组前期的研究已证实在CTEPH增生内膜组织来源的血管平滑肌细胞中存在线粒体异常分裂的现象，并且发现线粒体的异常分裂促进了CTEPH中血管平滑肌细胞增殖迁移参与的血管重塑，为了证实AQP1是否可以调节线粒体的结构改变以及功能异常，通过投射电子显微镜、Western Blot等实验观察AQP1对线粒体的结构和功能的影响。为了进一步研究其可能的机制，通过Western Blot实验观察CaMKⅡ/ERK1/2信号通路的激活情况，以及抑制此信号通路激活对线粒体结构（融合和分裂）和功能（膜电位、活性氧的产生等）的影响。也观察了抑制CaMKⅡ/ERK1/2信号通路对血管平滑肌细胞增殖迁移功能的影响。同时，有研究表明AQP1除了作为水通道蛋白参与水分子的转运，还可以作为其他小分子（如H2O2）的通道参与细胞的功能。为了验证AQP1是否作为H2O2的一个通道参与调节CTEPH中血管平滑肌细胞的功能，通过抑制AQP1的表达（胞外H2O2入膜的通道）和/或抑制线粒体的分裂（胞内H2O2产生的重要途径），观察不同处理对细胞内H2O2产生的影响以及细胞内H2O2对血管平滑肌细胞增殖迁移的影响;同时，还进一步观察了引起细胞内增多的H2O2的可能来源;最后，利用自体血栓经颈静脉注入肺动脉内制造CTEPH的小鼠模型（包括野生型小鼠和AQP1敲除小鼠），在动物体内观察AQP1对线粒体结构和功能的影响以及其对血管平滑肌细胞增殖迁移影响，还分离了CTEPH模型小鼠（包括野生型小鼠和AQP1敲除小鼠）的肺动脉血管平滑肌细胞，在体外观察AQP1敲除后对血管平滑肌细胞线粒体结构功能的影响以及对血管平滑肌细胞增殖迁移功能改变的影响。 结果: (1)RNA-Seq测序结果显示，CTEPH患者增生内膜组织来源的血管平滑肌细胞功能富集主要集中在血管平滑肌细胞的增殖与迁移和心血管功能; (2)参与CTEPH血管平滑肌细胞增殖与迁移的最重要的AQP家族蛋白亚型是AQP1，且AQP1在CTEPH患者中与其临床症状成正相关; (3)体外人和小鼠肺动脉来源的血管平滑肌细胞功能实验显示，AQP1可以促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移，抑制AQP1的表达可以缓解CTEPH血管平滑肌细胞的增殖与迁移; (4)AQP1可以促进血管平滑肌细胞中线粒体的异常分裂、增加线粒体H2O2的产生，降低线粒体膜电位的产生，抑制AQP1的表达可以缓解血管平滑肌细胞中线粒体的分裂和H2O2的产生; (5)AQP1激活CaMKⅡ/ERK1/2信号通路促进线粒体的分裂和功能异常，利用KN93抑制CaMKⅡ的激活可以缓解AQP1过表达导致的血管平滑肌细胞中线粒体的分裂和功能异常，并缓解血管平滑肌细胞的异常增殖与迁移; (6)AQP1可以作为H2O2的重要运输通道增加胞内H2O2的产生; (7)NOX4可能是胞外H2O2产生的重要部位，利用NOX4的抑制剂VAS2870和GLX351322可以明显的降低胞内活性氧的含量; (8)体外H2O2刺激可以促进血管平滑肌细胞的增殖与迁移，并且具有时间和浓度的依赖性; (9)CTEPH模型小鼠体内以及分离的原代血管平滑肌细胞证实:AQP1基因敲除可以明显减少肺动脉内膜的增厚，降低肺动脉压力，减少其中血管平滑肌细胞的增殖以及细胞中线粒体的过度分裂，同时也可以降低CaMKⅡ/ERK1/2信号通路的激活。 结论: 1.AQP1能促进CTEPH中血管平滑肌细胞的增殖与迁移，参与CTEPH的发生发展; 2.AQP1可以通过刺激线粒体结构和功能的改变来调节血管平滑肌细胞的功能; 3.H2O2是促进血管平滑肌细胞功能改变的关键分子; 4.AQP1作为胞外H2O2的通道增加胞内H2O2水平; 5.NOX4可能是胞外H2O2产生的关键部位。

关键词

慢性血栓栓塞性肺动脉高压/病理机制/水通道蛋白-1/血管平滑肌细胞/线粒体功能/过氧化氢/调节机制

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授予学位

博士

学科专业

外科学

导师

刘鹏

学位年度

2022

学位授予单位

北京协和医学院

语种

中文

中图分类号

R5
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