摘要
目的： 因感染旋毛虫引起的旋毛虫病，在世界范围内分布广泛，其主要的感染途径是生食或半生食含旋毛虫的肉类。探寻参与旋毛虫生长发育过程相关蛋白，并通过研究其功能以及作用机制，对于抗旋毛虫药物的筛选以及相关疫苗的研究，均有着十分重要的意义。 焦磷酸酶（Inorganic Pyrophosphatase，PPase），参与生命体生物大分子合成的过程，是寄生虫整个生活史中必不可少的一种催化类蛋白酶。目前寄生虫焦磷酸酶的研究主要集中在原虫、血吸虫、秀丽隐杆线虫和蛔虫，均认为在虫体生长发育以及蜕皮过程中，焦磷酸酶发挥着关键作用，但是该蛋白酶在旋毛虫生长发育过程中起着何种作用尚未见报道。本次研究选取了旋毛虫焦磷酸酶(TsPPase)，通过基因重组技术将TsPPase克隆表达，获得重组TsPPase蛋白(rTsPPase)并检测其酶活性;采用RNA干扰技术研究TsPPase在旋毛虫幼虫蜕皮过程中发挥的作用。构建TsPPase/NC8乳酸杆菌疫苗并免疫小鼠，探究了TsPPase抗旋毛虫感染的免疫保护功能。本研究所得结果有利于揭示旋毛虫TsPPase的生物学特性以及其在旋毛虫蜕皮及生长发育过程中的作用，并为后续抗旋毛虫感染疫苗和药物的研发奠定了基础。 方法： 1.旋毛虫、实验小鼠、细胞及伦理 使用昆明小鼠将旋毛虫(ISS534)于本实验室保种并传代;自河南省动物实验中心购回的BALB/c小鼠进行相关动物实验;实验中用的小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells，IECs)由本实验室人员从胎鼠分离培养获得，C2C12细胞（小鼠成肌细胞）系实验室保存。动物实验符合郑州大学生命科学道德委员会的规定(No.SCXK2017-0001)。 2.TsPPase基因的克隆表达和生物学特性分析 旋毛虫焦磷酸酶TsPPase基因通过NCBI从旋毛虫全基因组中获得，利用在线生物信息学软件对其进行生物信息学分析。利用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA中扩增出TsPPase基因，构建表达载体pQE-80L/TsPPase并克隆进入大肠杆菌原核表达系统，表达并纯化出了rTsPPase蛋白，将rTsPPase免疫小鼠获得rTsPPase免疫血清。利用RT-PCR、Real-time PCR、western blot和免疫荧光试验(IFA)对TsPPase在不同旋毛虫发育阶段（新生幼虫NBL、肌幼虫ML、肠道感染性幼虫IlL、成虫AW）的转录水平、蛋白表达水平和定位进行了相关研究。 3.rTsPPase酶活性分析及点突变 采用钼蓝比色法，以特异性底物焦磷酸盐(PPi)以及ATP作为底物对rTsPPase酶活性进行相应的检测。获得酶活的最佳表达条件;检测抑制剂NaF和IDP对rTsPPase酶活性的抑制作用;检测酶动力常数Km:分析了旋毛虫不同时期虫体可溶蛋白中天然TsPPase的相对酶活性。 TsPPase通过金属结合位点与2价金属离子结合从而发挥其催化活性，利用点突变技术将TsPPase基因中金属结合位点对应碱基突变，使其不能与金属离子结合，分析了突变前后rTsPPase的酶活性变化情况。 4.rTsPPase与IECs蛋白的结合 以C2C12细胞为对照，利用Far-western blot技术检测了rTsPPase与IECs细胞蛋白的结合;IFA试验用于检测rTsPPase与小鼠小肠、肌肉和肝组织间的结合状况;研究检测了旋毛虫侵入IEC单层细胞时，rTsPPase及其抗血清对幼虫侵入的影响。 5.RNAi抑制TsPPase基因转录表达以及天然TsPPase酶活性 根据TsPPase基因，设计并合成相应的特异性siRNA-279，并以Control-siRNA作为对照，经电穿孔法将siRNA-279导入旋毛虫幼虫体内。通过qPCR和western blot对处理后虫体中TsPPase的转录和表达水平进行检测;收集RNAi处理前后的旋毛虫幼虫，对虫体可溶性蛋白催化降解PPi水平进行检测，分析比较RNA干扰前后PPi降解水平的变化。 6.RNAi抑制TsPPase基因对旋毛虫肠道期幼虫蜕皮的影响 体外培养旋毛虫IIL，分别用抗rTsPPase血清、抑制剂NaF和siRNA对幼虫进行处理，设立正常幼虫为对照，观察培养过程中不同组间旋毛虫幼虫发育以及蜕皮状况，分析抗血清、抑制剂和RNAi对幼虫发育的影响。 将抑制剂NaF及RNAi处理后的IIL，分别经口接种小鼠，观察抑制剂及RNAi对IIL在肠道内蜕皮与发育的抑制或阻断作用，光镜下观察比较不同组间虫体的发育蜕皮能力，并在电子显微镜下观察虫体超微结构，比较实验组和对照组间的差异。 结果： 1.TsPPase的克隆表达和功能鉴定 生物信息学分析表明TsPPase基因无信号肽、无跨膜区、亲水，全长1104bp，编码367个氨基酸，蛋白大小为41.48kDa，等电点(pI)为5.76。三级结构显示TsPPase含α螺旋2个和β折叠12个，其携带的金属结合位点和底物结合位点是蛋白发挥作用的主要位点。通过原核表达系统成功表达并纯化出rTsPPase，分子量约为44kDa，由于rTsPPase携带His-tag，蛋白分子量比预测稍大。 旋毛虫整个生活史中均有TsPPase基因与蛋白转录表达。所有虫期的可溶性蛋白中均可通过rTsPPase免疫血清识别出天然TsPPase蛋白，在ML、IIL和AW时期的ES蛋白（排泄分泌蛋白）中也存在有天然TsPPase蛋白的识别。IFA试验结果表明:TsPPase蛋白主要定位于旋毛虫虫体表皮、杆状体以及胚胎周围。 2.TsPPase酶活特性及点突变结果 钼蓝比色法检测rTsPPase结果表明，rTsPPase具有促进PPi降解为Pi的催化酶活性，以PPi为底物时，当温度为50℃，pH7.5，镁离子浓度为5mM时，rTsPPase可以发挥其最大催化活性，通过米氏方程可以求出此时酶动力常数Km值为170μM，最大反应速率Vmax为81.96μmol Pi/min/mg。此外，rTsPPase还可以催化ATP降解为ADP和Pi，其最佳反应条件为:50℃，pH6.0，镁离子浓度为10mM，在此条件下，其表现出的Km值为108μM，Vmax为1.816μmol Pi/min/mg。特异性抑制剂NaF可以有效地抑制rTsPPase的酶活性，且抑制作用随NaF浓度上升而增强，同时IDP也对rTsPPase酶活性具有抑制作用。不同虫期天然TsPPase酶活性检测结果显示10h IIL期TsPPase酶活性最强，且在整个IIL阶段，TsPPase均表现出很强的酶活性。 将TsPPase的金属结合位点突变后，表达纯化所得的焦磷酸酶(M-TsPPase)表现出的酶活性同正常rTsPPase相比较，下降了75.67％，酶活性被显著抑制(x2=122.581，P＜0.05)。 3.rTsPPase与IECs的结合作用 Far-western blot结果表明，rTsPPase与IECs蛋白之间存在特异性结合，但在rTsPPase与C2C12细胞蛋白之间没有结合。IFA表明rTsPPase可以与小肠、肌肉组织结合，但不能和肝组织结合。体外侵入实验结果表明:rTsPPase可以促进旋毛虫幼虫侵入IECs细胞单层，当浓度低于15μg/mL时，没有促进作用;抗rTsPPase血清对幼虫侵入细胞单层具有抑制作用，在血清稀释度为1∶100和1∶200的条件下，抑制率分别为37.23％和24.80％（P＜0.05），提示TsPPase参与了旋毛虫的侵入过程。 4.RNAi对TsPPase表达及酶活性的抑制作用 当siRNA-279经电穿孔法导入虫体后，可在镜下观察到明显的荧光，通过计数得到siRNA-279导入率为80.97％，未导入率为19.03％，电击后虫体死亡率为3.67％。qPCR实验结果表明虫体经不同浓度siRNA-279干扰后，TsPPase转录水平明显下降(P＜0.05)，4μM为siRNA-279的最佳干扰浓度，在该浓度siRNA-279的干扰作用下，天然TsPPase蛋白表达量明显下降，抑制率为33.34％（P＜0.05）。4μM的siRNA-279处理虫体后培养1天，TsPPase转录表达被有效抑制，且培养2天时抑制作用最佳，培养1、2和3天的ML中TsPPase转录水平与PBS组比较，转录水平分别下降了19.83％、38.37％和27.94％（P＜0.05），蛋白表达抑制率在培养第2天时为37.55％（P＜0.05）。 结论： 1.旋毛虫整个发育过程中均有TsPPase转录表达，主要定位于虫体表皮、杆状体和雌虫胚胎周围。 2.rTsPPase具有催化蛋白酶活性，能促进PPi降解为两分子的Pi;rTsPPase还能催化ATP降解为ADP和Pi。rTsPPase可以与IEC细胞蛋白特异性结合，促进旋毛虫幼虫侵入宿主肠上皮。 3.RNAi结果证实TsPPase参与了旋毛虫幼虫的蜕皮与发育。 4.TsPPase/NC8乳酸菌经口服免疫小鼠后，诱导了全身性Th1/Th2混合型免疫应答与肠黏膜免疫应答，对旋毛虫攻击感染产生了明显的免疫保护效果，因此TsPPase可作为抗旋毛虫疫苗的候选靶分子。
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