摘要
肌苷-磷酸(IMP)作为重要的嘌呤核苷酸，它不仅是一种重要的鲜味物质，而且作为嘌呤核苷酸代谢重要产物，它也是生命生存繁衍的基础。研究表明IMP从头合成途径影响细胞的增殖和凋亡。IMP从头合成途径受多个基因表达和信号传导的影响，而基因的表达水平也受到多种因子的调控，转录后调控和表观遗传修饰是影响基因表达量水平的重要机制。研究发现非编码RNA(ncRNA)包括microRNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)参与基因的转录后调控，并且越来越多的研究显示这些ncRNA参与骨骼肌的生长发育。静原鸡是国家畜禽保护品种，也是宁夏地区5个畜禽保护品种之一。本研究以静原鸡为试验材料，利用转录组测序(RNA-seq)技术和生物信息学分析筛选影响静原鸡骨骼肌细胞增殖、分化和凋亡的关键circRNA。同时利用过表达试验，敲除试验，实时荧光定量PCR(RT-PCR)，双荧光素酶基因报告系统，RNase R消化试验，亚细胞定位试验，CCK-8试验，EDU试验，酶联免疫吸附(Elisa)试验等对关键circRNA和miRNA进行细胞功能验证。主要研究结果如下: (1)本研究利用RNA-seq技术，鉴定静原鸡肌肉组织中circRNA的表达谱，共鉴定出circRNA9456个，其中有2111个circRNA在胸肌中鉴定出，2148个circRNA在腿肌中鉴定出的，在胸肌和腿肌中共同鉴定出的circRNA5197个。共筛选出差异表达ckcRNA516个，其中188个上调，328个下调。circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析共得到42个差异表达circRNA，6个差异表达miRNA，12个差异表达基因，其中神经颗粒蛋白(NRGN)、丙酮酸激酶2(PKM2)和三磷酸外核苷二磷酸水解酶7(ENTPD7)差异性最大。此外，RT-PCR结果显示，circRNA的测序和定量结果一致，可用于后续circRNA的功能验证。 (2)通过发散引物和聚合引物进行PCR扩增以及RNaseR的消化试验确定circACLY为来自于ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)基因第2-3外显子的circRNA。对circACLY的亚细胞定位试验circACLY主要存在于细胞质。此外，成功构建circACLY与ENTPD7的野生型/突变型双荧光素酶报告基因载体，双荧光素酶报告基因系统检测证实gga-miR-6660-3p能够直接与cirACLY和ENTPD7的结合位点结合，并且circACLY能够吸附gga-miR-6660-3p提升ENTPD7的表达水平。 (3)通过RT-PCR、CCK-8、EDU、Elisa和诱导分化试验等发现，gga-miR-6660-3p在静原鸡不同组织部位和不同发育阶段差异表达，并且gga-miR-6660-3p抑制IMP从头合成途径促进成肌细胞的凋亡，抑制成肌细胞的增殖和分化。 (4)通过RT-PCR、CCK-8、EDU和Elisa试验等发现，circACLY在静原鸡不同组织部位和不同发育阶段差异表达，circACLY促进成肌细胞的增殖、分化和IMP从头合成途径，消除gga-miR-6660-3p对成肌细胞增殖、分化和IMP从头合成途径的抑制作用。此外，circACLY抑制成肌细胞的凋亡，消除gga-miR-6660-3p对成肌细胞凋亡的促进作用。 综上，本研究对静原鸡circACLY海绵吸附gga-miR-6660-3p调控IMP从头合成途径影响成肌细胞的增殖、分化和凋亡进行了系统研究，丰富了circRNA在地方鸡种中骨骼肌发育和IMP合成的调控机制，为畜禽肉质遗传改良提供一定的理论基础。
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