摘要
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，P.multocida)和溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica，M.haemolytica）是栖息于牛呼吸道的两种常见细菌，可引发牛的呼吸道疾病，对养殖业产生一定经济损失。因此，建立同时检测这两种细菌的检测方法具有现实意义。目前，牛源P.multocida在我国广泛流行，研究P.multocida的耐药性、耐药基因及毒力基因，对了解该细菌的流行特点、预防和治疗可以提供理论参考。 1.为提高这两种细菌所导致疾病的临床诊断效率，本研究针对P.multocida的Kmt1基因、M.haemolytica的Lkt基因序列分别设计了特异性引物，建立了一种同时检测两种细菌的双重PCR检测方法。结果显示，建立的双重PCR方法对其他牛源细菌及病毒检测结果均为阴性，P.multocida、M.haemolytica病原基因组DNA的检测下限分别为1.57×105copies/μL，1.98×106copies/μL，表明该方法具有较好的特异性和敏感性。应用此双重PCR方法对宁夏地区118份有呼吸道症状的病牛临床样品进行检测，结果显示P.multocida检出率57.63％(68/118)，M.haemolytica检出率30.51％(36/118)，混合感染检出率24.58％(29/118)。与经典单一PCR检测方法相比，P.multocida、M.haemolytica总符合率分别为91.53％，94.07％，表明该方法可用于临床检测。 2.将上述双重PCR方法鉴定为P.multocida阳性的样品进行分离培养，通过观察血平板培养基上菌落形态，革兰氏染色镜检和PCR特异性扩增的方法进行P.multocida的鉴定，结果分离出P.multocida14株，分离率20.59％(14/68)。 3.采用PCR方法对分离到的14株P.multocida进行荚膜血清型、脂多糖基因型、MLST分型。结果显示，11株为A:L3型，3株为B:L2型;1株血清A型P.multocida为ST188型，1株血清B型P.multocida为ST187型。 4.14株P.multocida菌株的药物敏感性试验结果显示，分离到的14株P.multocida对氨苄西林均耐药，耐药率为100％，对头孢唑和头孢噻肟耐药菌株数较多，耐药率为78.57％，对四环素中介菌株数较多，对庆大霉素和诺氟沙星敏感性为100％。 5.采用PCR方法对14株P.multocida进行了10种耐药基因和27种毒力基因的检测。结果显示，只有一种耐药基因β-内酰胺类blaTEM耐药基因被检出，检出率100％。已检测的27种毒力基因，14株P.multocida共携带20种毒力基因，携带率为74％。 6.对分离到的一株血清A型P.multocida进行毒力基因ptfA测序，分析基因序列一致性和进化关系以及生物信息学分析。结果显示，该分离株ptfA基因序列与NCBI收录的部分株序列一致性为98.6％～100％;与伊朗牛源P.multocida(KX679397.1)来自于同一分支。PtfA基因序列全长435bp，编码144个氨基酸，该基因编码的蛋白为疏水性蛋白，有1个跨膜区域，无信号肽，潜在的磷酸化位点有12个，亚细胞定位主要在内质网。二级结构中存在大量的α螺旋和无规则卷曲，包含5个抗原表位。
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