摘要
奶牛乳腺炎是一种发病率极高的疾病，给牧场造成巨大的经济损失。奶牛乳腺上皮细胞（bMECs）是奶牛乳腺发挥功能的主要细胞，也是病原体入侵奶牛乳腺组织的第一道屏障，在乳腺固有免疫中起着重要的功能。MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码小RNA，已被证明可在转录后水平调控基因表达并参与多种生物学过程。前期的研究表明miR-199a-3p能够调控小鼠和人的多种细胞功能。然而，miR-199a-3p在bMECs炎症反应中的分子作用还未被探索。为深入研究miR-199a-3p在奶牛乳腺炎中的功能，本研究拟从分子和细胞水平研究miR-199a-3p在bMECs炎症反应过程中的表达模式及其分子调控作用，并探索miR-199a-3p对bMECs炎症反应中的细胞增殖与凋亡的影响。主要研究结果如下: (1)采用RNA-seq技术检测了过表达miR-199a-3p组和对照组bMECs中的转录组，并进行了差异表达mRNA的筛选及功能注释。结果表明，与对照组相比，过表达miR-199a-3p组有140个差异表达的mRNA(其中上调mRNA109个，下调mRNA31个);KEGG及GO分析结果表明，上述差异mRNA可能通过调控PI3K-Akt信号通路、TGF-β信号通路和IL-17信号通路而参与机体免疫和炎症反应调控过程。这些结果提示miR-199a-3p可能通过影响相关mRNA表达，并通过上述信号通路而调控奶牛乳腺炎。 (2)利用生物信息学方法和文献资料预测出SP1、MTOR、PTPRF、CD2AP、BCAR3、NET1和CNOT7为miR-199a-3p的潜在靶基因。本研究构建了上述7个潜在靶基因mRNA3''UTR双荧光素酶报告基因重组载体，并通过双荧光素酶报告基因实验鉴定了miR-199a-3p与上述潜在靶基因调控关系。结果表明，CD2AP为miR-199a-3p的靶基因;miR-199a-3p与其他的6个mRNA不存在靶向调控关系。 (3)采用qRT-PCR技术检测了miR-199a-3p在LPS诱导bMECs产生炎症反应中的表达水平，结果表明，与0h相比，miR-199a-3p在LPS诱导炎症反应的3、6、12和24h的表达量均上调，其中6h和12h极显著上调（P＜0.01），6h上调最多，提示miR-199a-3p可能在bMECs炎症反应中具有调节作用。 (4)建立了超表达及抑制miR-199a-3p的炎症性bMECs模型，并检测了靶基因CD2AP及PI3K/AKT/NF-κB信号通路关键基因及蛋白表达、炎症因子基因表达及分泌，以及细胞增殖及凋亡情况。结果表明，超表达miR-199a-3p能显著抑制靶基因CD2AP的mRNA及蛋白、信号通路关键基因（IK3CA、PIK3R1、AKT1、AKT3、IKB1KB、RELA和TLR）及蛋白(PI3K、AKT和p-p65)、炎症因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）及凋亡基因(CASP3和CASP9)的mRNA表达。同时，抑制炎症因子分泌，促进bMECs的增殖并抑制其凋亡。抑制miR-199a-3p后，获得了与超表达miR-199a-3p相反的实验结果。这些结果提示miR-199a-3p抑制了bMECs的炎症反应及细胞凋亡。 综上所述，miR-199a-3p通过靶向CD2AP基因并调节PI3K/AKT/NF-κB信号通路，抑制了LPS诱导的bMECs炎症反应及细胞凋亡。研究结果为乳腺炎分子治疗提供了一个潜在的靶点，也为抗乳腺炎奶牛分子育种奠定基础。
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