摘要
克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF)是由克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）引起的蜱传病毒性疫病，致死率为20％-30％，广泛流行于亚洲、欧洲、非洲等多个地区。近年来，该病有向更广的范围扩散的趋势，因此研究这种疾病的对公众健康具有重大意义。研制疫苗是控制CCHF传播的主要措施，1970年苏联批准使用的灭活疫苗，仅能引起部分CCHF患者的体液免疫;2006年研制的CCHF核酸候选疫苗因不能有效进入细胞而被核酸酶降解;2010年研制的CCHF活载体疫苗能保护部分小鼠免受CCHFV的感染，但载体的抗性影响疫苗的免疫效果等缺陷，致使目前仍缺乏安全有效的疫苗来预防这种疾病。杆状病毒表面展示疫苗和Zera纳米颗粒疫苗可以避免这些缺点，尤其是其自身具有佐剂性质和安全性。基于此，本研究以昆虫杆状病毒表面展示系统和Zera自组装系统分别表达中国新疆株HANM-18(MN832721)的刺突蛋白Gn和核衣壳蛋白Np，制备了rvAc-Gn、rvAc-Np、rvAc-Gn-Np、Zera-Gn和Zera-Np5种纳米颗粒，并将其作为候选疫苗免疫BALB/c小鼠，在小鼠体内评估免疫效果。通过实验，获得如下结果: 1.构建CCHFV Gn和Np蛋白的原核表达体系，将表达纯化获得的Gn和Np蛋白作为免疫原免疫兔子，制备Gn和Np的兔多克隆抗体，间接ELISA法检测Gn效价为1∶524288，Np兔多克隆抗体效价为1∶1048576，可供后续实验使用。 2.在杆状病毒表达系统中构建携带有Gn-mCherry和Np-eGFP的表面展示载体和Zera自组装载体，并将其转染Sf9细胞，获得rvAc-Gn-mCherry、rvAc-Np-eGFP、rvAc-Gn-mCherry-Np-eGFP、Zera-Gn-mCherry和Zera-Np-eGFP5种荧光纳米颗粒，通过直接荧光和间接荧光确定5种纳米颗粒均能在细胞内表达;通过免疫电镜对展示纳米颗粒观察，确定Gn和Np蛋白展示于杆状病毒表面。 3.对上述载体去荧光标签改造;转染Sf9细胞，得到rvAc-Gn、rvAc-Np、rvAc-Gn-Np、Zera-Gn和Zera-Np5种纳米颗粒，将Western Blot鉴定正确的纳米颗粒作为疫苗免疫BALB/c小鼠，间接ELISA结果表明，与PBS和野生型杆状病毒组相比，首次免疫42d的Gn和Np的展示颗粒和Zera自组装颗粒均可以诱导小鼠产生高水平的体液免疫(P＜0.001);脾淋巴细胞增值实验结果表明:5种纳米颗粒均可以诱导小鼠产生显著的细胞免疫，并提升小鼠IL-4和TNF-α的表达水平（P＜0.001）;有趣的是，与对照组相比，rvAc-Gn-Np二联展示颗粒脾淋巴细胞刺激指数明显升高，但IL-4和TNF-α表达水平与对照组无差异，说明Gn-Np的共同展示策略不可用。在杆状病毒表面展示和自组装两种表达策略中，Gn蛋白的免疫原性均显著高于Np蛋白，并且Zera自组装颗粒能显著提升Gn和Np的细胞免疫水平。 综上所述，杆状病毒表达系统Zera自组装颗粒能显著提升Gn和Np蛋白的免疫原性，并且Gn的免疫原性显著强于Np;Zera-Gn在体液免疫和细胞免疫水平显著其他组，表明Zera-Gn自组装纳米颗粒疫苗有作为CCHF候选疫苗的潜力;同时该研究为CCHF杆状病毒Zera自组装纳米颗粒疫苗和表面展示疫苗研制提供理论参考。
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