摘要
目的：纳豆激酶（Nattokinase，NK）是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B.subtilis）在发酵过程中产生的一种丝氨酸蛋白酶，具有溶解血栓的功效。然而，发酵的代谢产物组成缺乏系统分析且NK功效评价尚不够全面。本研究旨在筛选高产NK菌株并优化其液态发酵的配方及条件，通过代谢组学分析不同发酵原料的代谢产物差异，在此基础上，评价以红芸豆为原料发酵产生的NK在溶解血栓、口腔溃疡康复和治疗非酒精性脂肪肝（NAFLD）方面的作用，为NK的临床转化及应用提供实验依据。 方法：首先，使用酪蛋白平板和摇瓶发酵筛选高产NK的菌株，并通过细菌形态、生理生化指标及16S rDNA鉴定该菌株的种属；通过单因素试验确定该菌株的最佳发酵条件，包括发酵时间、接种量等；其次，通过代谢组学分析以红芸豆和黄豆为原料的培养基中的差异代谢产物，并通过高效液相色谱法检测培养基中嘌呤的含量；最后，通过NK溶解血凝块和小鼠尾静脉血栓的实验，评价NK在体内外溶解血栓的效果；通过称量口腔溃疡模型小鼠的体重、观察溃疡创面愈合情况以及通过溃疡组织Hamp;E染色等指标，评价NK对小鼠口腔溃疡的治疗作用；通过观察NAFLD模型小鼠体形变化和肝脏大小，检测肝脏组织中丙二醛（MDA）和血清中血脂水平，以及免疫组化检测肝组织中脂肪转运相关指标，评价NK对NAFLD的治疗作用。 结果：（1）成功筛选出了高产NK的菌株ZY，并鉴定其为枯草芽孢杆菌属，命名为B.subtilis ZY。（2）B.subtilis ZY的最佳液态发酵配方为红芸豆2%、葡萄糖2%、磷酸氢二钠0.2%、磷酸二氢钠0.1%、硫酸镁0.1%、氯化钙0.1%，最佳液态发酵条件为菌液接种量0.8%、pH7.0。（3）代谢组学结果表明，B.subtilis ZY使用红芸豆和黄豆为原料发酵的代谢模式不同，KEGG代谢通路分析共富集到20条差异代谢通路，其中显著富集的通路共7条。差异代谢物聚类分析表明，红芸豆培养基发酵代谢物中富含更多有益成分，包括谷胱甘肽、透明质酸以及三萜类等，且嘌呤含量为4.17mg/100g，仅为黄豆培养基的1/26。（4）体外血栓溶解结果表明，与NK接触的血块颜色变深并出现凹陷，并且NK治疗组小鼠的尾静脉血栓长度明显变短，说明NK可以有效溶解血栓。（5）成功建立小鼠口腔溃疡模型，饲喂和涂抹含有高活性NK的纳豆激酶粗提液（NCE），结果表明，NCE组小鼠的相对体重增加，并且溃疡创面明显减小，伤口愈合的进程缩短，说明NK抑制了溃疡部位的炎症反应，促进了口腔黏膜上皮再生。（6）NCE组中NAFLD小鼠的相对体重减轻、肝组织中的MDA含量以及小鼠血清中TG、TC及LDL水平均明显降低，并且小鼠肝脏的外观恢复了正常的红褐色及大小，组织中脂肪空泡明显减少，胶原纤维含量也显著降低，改善了肝脂肪变性。此外，肝组织中CD36表达降低，LDLR表达增高，减少了肝脏细胞对脂肪酸的摄取，改善肝脏细胞的脂质代谢，达到治疗NAFLD的作用。 结论:高产NK菌株B.subtilis ZY以红芸豆为发酵原料，在最适液态发酵条件下，产生的代谢产物中富含谷胱甘肽等更多有益成分且嘌呤含量低，产生的高活性NK可以有效溶解血栓、治疗口腔溃疡和NAFLD。
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