摘要
目的： 心脏纤维化是多种心血管疾病的共同病理特征，主要表现为促纤维化介质释放，成纤维细胞转分化（Fibroblast-to-myofibroblast transition,FMT），细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）大量沉积，引起心室重构，严重损害心脏功能。及时干预纤维化进程，对心血管疾病的治疗具有重要临床意义，但目前尚无有效逆转心脏纤维化的方法。白介素-22（Interleukin-22,IL-22）是IL-10细胞因子家族成员之一，能调节细胞代谢，发挥心脏保护作用，但其对心脏纤维化的调控作用尚不完全清楚。因此，本课题以心肌梗死（Myocardial infarction,MI）为模型，阐释IL-22对心脏损伤后心肌纤维化的拮抗作用，并从代谢的角度探讨其潜在机制。 方法： （1）体内探究IL-22对小鼠MI后心脏纤维化的影响：将小鼠随机分为对照组、MI组及IL-22处理组，通过冠状动脉结扎术构建小鼠MI模型，建模后第四天尾静脉注射IL-22（0.1mg/kg），隔天注射，一共七次。MI后第21天留取小鼠血清和心脏组织。ELISA检测小鼠血清IL-22、血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）及转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）水平，HE染色观察心脏结构改变及梗死情况，天狼星红染色评估心脏纤维化程度。 （2）体外验证IL-22对心脏FMT的影响：原代心肌成纤维细胞分为对照组、AngⅡ组及AngⅡ+IL-22组，Western blot和免疫荧光检测IL-22对纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Ⅰ型胶原（TypeⅠcollagen,Cola1）及Ⅲ型胶原（TypeⅢcollagen,Cola3）表达的影响。 （3）明确IL-22对FMT过程中代谢重编程的作用：首先通过qRT-PCR技术检测AngⅡ诱导FMT过程中主要代谢酶或代谢调控因子的表达情况，筛选改变最显著的代谢途径（糖酵解途径），为后续实验奠定基础。原代心肌成纤维细胞分为对照组、AngⅡ组及AngⅡ+IL-22组，检测IL-22对FMT过程中糖酵解关键酶己糖激酶2（HK2）、丙酮酸激酶M2（PKM2），以及糖酵解分支丝氨酸/甘氨酸合成途径酶磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）、磷酸丝氨酸磷酸酶（PSPH）的影响，生化试剂盒测定心肌成纤维细胞糖酵解终产物乳酸含量。接着，通过体内实验检测小鼠心脏PKM2表达，进一步验证IL-22对有氧糖酵解的影响。 （4）探究IL-22抑制FMT是否依赖于有氧糖酵解。将原代心肌成纤维细胞分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+IL-22组及AngⅡ+IL-22+糖酵解激动剂组，测定纤维化标志物及糖酵解酶的水平。 （5）初步探究IL-22调控有氧糖酵解的机制：IL-22处理原代心肌成纤维细胞，Western blot检测JNK通路及ERK通路的磷酸化水平。随后聚焦于改变显著的JNK通路，将细胞分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+IL-22组及AngⅡ+IL-22+JNK抑制剂组，生化试剂盒测定PK活性。 结果： （1）MI后第21天，小鼠血清IL-22水平降低，AngⅡ及TGF-β1含量升高。外源性IL-22干预MI后，小鼠血清中AngⅡ及TGF-β1水平降低。HE染色及天狼星红染色结果显示，MI小鼠心脏组织发生心腔扩大、心室壁变薄、心肌纤维紊乱及胶原沉积等病理性改变，注射IL-22可减少梗死面积，减轻纤维化程度。 （2）体外结果显示，IL-22降低AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞α-SMA、Cola1及Cola3的表达，表明IL-22能抑制AngⅡ诱导的体外FMT。 （3）AngⅡ诱导FMT过程中，心肌成纤维细胞代谢相关基因表达水平改变，以糖酵解途径最为显著。外源性IL-22降低了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞HK2及PKM2水平，抑制PHGDH及PSPH的表达，同时减少心肌成纤维细胞胞内乳酸含量。同时，体内实验证实IL-22降低了MI小鼠心脏PKM2水平。 （4）与AngⅡ+IL-22组相比，AngⅡ+IL-22+糖酵解激动剂组心肌成纤维细胞的纤维化及糖酵解水平回升。 （5）IL-22升高JNK通路磷酸化水平，而对ERK通路无明显影响。后续实验证明，AngⅡ可诱导心肌成纤维细胞糖酵解关键酶PKM2活性降低，IL-22干预后PKM2活性回升，而抑制JNK通路可部分逆转IL-22对PKM2活性的作用。 结论： （1）IL-22可通过抑制有氧糖酵解缓解MI后心脏纤维化及AngⅡ诱导的FMT。 （2）IL-22可通过激活JNK/PKM2通路下调有氧糖酵解水平。
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